Role of neuromediators in the development of skin inflammation in patients with atopic dermatitis

Full Text

Атопический дерматит - хроническое воспалительное заболевание кожи, начинающееся, как правило, в младенческом или детском возрасте. В патогенезе атопического дерматита ведущая роль отдается двум факторам - разрушению защитного липидного барьера и нарушениям иммунологической реактивности организма со сдвигом баланса между Th 1 - и Th2- лимфоцитами в сторону последних и повышением продукции соответствующих Т1п2-цитокинов [1-3]. Соответственно патогенетическая терапия больных атопическим дерматитом направлена на коррекцию защитного барьера кожи и подавление патологических Т1п2-клеточных реакций [4]. В то же время развитие и течение иммунных реакций в коже находится под влиянием периферической нервной системы [5, 6]. Кожа считается наиболее обильно иннервированным органом человека [7]. Важное место в патогенезе хронических воспалительных дерматозов занимают чувствительные нервные С-волокна, окончания которых воспринимают действие пруритогенных стимулов и, следовательно, участвуют в формировании чувства зуда. От степени выраженности иннервации кожи нервными С-волокнами, которые представляют собой аксоны нейронов дорсального ядра спинного мозга, зависит интенсивность зуда у больных хроническими воспалительными дерматозами. Повышение плотности иннервации кожи, проникновение нервных волокон из дермы в эпидермис являются факторами, снижающими порог восприятия пруритогенных стимулов и способствующими развитию зуда. Помимо своей основной функции - воспринимать стимулы внешней среды - чувствительные нервные волокна кожи способны влиять на развитие и течение воспалительной реакции в коже. Свободные нервные окончания, располагающиеся в коже, тесно примыкают к кератиноцитам и тучным клеткам, обеспечивая структурную основу для взаимодействий между этими клетками и нервными волокнами. При активации из нервных окончаний С-волокон выделяются нейропептиды, например CGRP и субстанция Р. Нейропептиды, действуя через свои рецепторы, могут воздействовать на тучные клетки, лимфоциты, кератиноциты, стимулируя продукцию цитокинов и других биомолекул, способных модулировать течение воспаления [6]. В свою очередь, кератиноциты могут направлять рост аксонов нейронов дорсального ядра спинного мозга, что показано в экспериментах с культурами клеток [8]. Кератиноциты и фибробласты дермы продуцируют как нейротрофные факторы, способствующие росту и ветвлению нервов, например фактор роста нервов [9, 10], так и хеморепелленты, прекращающие рост нервных волокон - семафорин-3А [11]. Поскольку эффекты влияния этих молекул на рост нервных волокон противоположны [12], их соотноше ние позволяет установить точный контроль над иннервацией кожи. Таким образом, нейропептиды и нейротрофи-ны могут участвовать в формировании чувства зуда и развитии воспалительной реакции в коже, в связи с чем определение роли нейропептидов и нейротро-финов в патогенезе атопического дерматита может представить информацию об этих молекулах как о потенциальных терапевтических мишенях. В первую очередь это обусловливает необходимость определения локализации нейропептидов и нейротрофинов в структурах кожи, что возможно с помощью иммуно-гистохимического и иммунофлуоресцентного исследования. Целью работы явилась оценка экспрессии нейропептидов и нейротрофинов в коже больных атопическим дерматитом. Материал и методы У 5 больных атопическим дерматитом в период обострения заболевания были получены биоптаты кожи из центральной части очагов поражения под местной анестезией (2% раствор лидокаина). Био-птаты делили на две части. Одну часть биоптатов фиксировали в 10% растворе забуференного формалина, подвергали стандартной гистологической проводке в автоматизированной вакуумной системе обработки тканей Leica ASP300 (Германия) путем обезвоживания в изопропиловом спирте. Далее кусочки ткани пропитывали парафином, заливали в парафиновые блоки, из которых на ротационном микротоме Leica RM2125RT (Германия) изготавливали срезы толщиной 5 мкм, растягивали на предметных стеклах с полилизиновым покрытием. Вторую часть биопта-тов заливали в среду для замораживания Tissue-Tek (Sakura, Netherlands) и помещали в морозильную камеру при температуре -30 °С. После замораживания на криостатном микротоме Slee (Германия) изготавливали срезы толщиной 5-6 мкм, растягивали их на предметных стеклах с полилизиновым покрытием, высушивали при комнатной температуре 25 °С в течение 30 минут. После полного высыхания стекла со срезами помещали в фольгу и хранили в морозильной камере при температуре -30 °С. Экспрессию маркера нервных волокон белка PGP9.5, амфирегулина, семафорина-3А, пептида, связанного с геном кальцитонина (cGRP) и его рецептора - CGRP-R, фактора роста нервов (NGF) и его рецептора TrkA, вещества Р (SP) и его рецептора -SP-R в структурах кожи больных атопическим дерматитом изучали иммуногистохимическим методом и методом иммунофлюоресцентного окрашивания (непрямая РИф). При проведении иммуногистохимического исследования и иммунофлюоресцентного исследования за основу были взяты стандартные протоколы иммуно- Вестник дерматологии и венерологии Научные исследования л 93 гистохимической реакции и реакции непрямой иммунофлюоресценции (нРИФ) [13, 14]. В качестве вторичных биотинилированных антител был использован реагент Histofine Simple Stain MA PO (Multi) (Nichirei biosciences, Япония). Полученные иммуногистохимические препараты изучали с помощью светового микроскопа Leica DM4000B (Германия), документировали цифровой камерой Leica DFC320 (Германия). Препараты, полученные в результате проведения реакции непрямой иммунофлюоресценции, анализировали и документировали на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе Olympus IX81S1F-S (Германия) с использованием объективов х 60 и х 100. В связи с тем, что различные комбинации нескольких обязательных этапов иммуногистохимического исследования (различная последовательность нанесения реактивов) могут критически влиять на качество иммуногистохимических препаратов, была проведена серия постановок иммуногистохимических реакций с использованием 3 протоколов, краткая последовательность выполнения которых представлена в таблице. В протоколах № 1 и 2 высокотемпературная демаскировка антигенных детерминант путем кипячения в цитратном буфере осуществлялась до нанесения пероксидазного блока, в протоколе № 3 - после нанесения пероксидазного блока. В протоколах № 2 и 3 перед инкубацией с первичными антителами на срезы наносился 5% раствор БСА (бычий сывороточный альбумин). При проведении серии экспериментов оптимальные результаты были получены в ходе проведения окраски согласно протоколу № 2, при использовании которого удалось добиться отсутствия неспецифического фонового окрашивания срезов. С целью достижения высокого качества иммуногистохимической окраски в протоколе № 2 был оптимизирован ряд стадий: ■ для достижения тщательной депарафинации срезов время пребывания стекол со срезами в термостате (+56°) было увеличено до 1 часа; ■ определено оптимальное рабочее разведение для всех концентрированных первичных антител -1:400. Также было отработано оптимальное время инкубации срезов с первичными антителами (60' в термостате при температуре +37°); ■ с целью демаскировки антигенных детерминант увеличено до 7' (трижды с 1-минутными перерывами) время кипячения срезов в цитратном буфере (рН 6,0); ■ лучшее качество иммуногистохимической окраски достигнуто за счет промывания срезов в растворе отмывающего фосфатного буфера, содержащего Tween20 (PBS+Tween20 рН 7,6 ± 0,2), и увеличения кратности и времени промывания срезов - 3 раза по 7'; ■ для предотвращения развития эндогенной перокси-дазной активности оптимизировано функционирование иммуно-пероксидазной полимерной системы Histofain за счет нанесения на срезы 5% раствора бычьего сывороточного альбумина, оптимальное время инкубации составило 60' при комнатной температуре. Приводим оптимизированный протокол иммуноги-стохимической окраски парафиновых срезов, при котором были получены оптимальные результаты. 1. Приготовление буферных растворов для демаскировки антигенных детерминант (цитратный буфер рН - 5,99-6,0) и для отмывания срезов в ходе реакции (ТРИС-буфер рН - 7,54-7,58; фосфатный буфер (PBS) рН - 7,4-7,8). 2. Предметные стекла со срезами помещаются в термостат (+56 °С) на 60 мин. 3. Для депарафинизации и дегидратации стекла со срезами из термостата последовательно помещаются в следующие жидкости: ■ ксилол - 5'; ■ ксилол - 5'; ■ ксилол - 5'; ■ ксилол - 5'; ■ этиловый спирт 96% - 5'; ■ этиловый спирт 96% - 5'. 4. Для регидратации стекла со срезами помещают в дистиллированную воду на 10'. 5. Для демаскировки антигенных детерминант стекла со срезами помещают в контейнер с цитрат-ным буфером (рН - 5,99-6,0), кипятят в СВЧ при мощности 900 Вт трижды по 7' с 1-минутными перерывами. 6. После остывания при комнатной температуре срезы промывают в дистиллированной воде в течение 5'. 7. Для предотвращения эндогенной пероксидазной активности на срезы наносят пероксидазный блок (инкубация во влажной камере при комнатной температуре в течение 15'). 8. Промывают срезы в PBS-буфере (или ТРИС-бу-фере) трижды по 7'. 9. На срезы наносят протеиновый блок - 5% раствор БСА, содержащий Tween20 (инкубация во влажной камере при комнатной температуре в течение 60). 10. Приготовление рабочих растворов первичных антител. 11. На срезы наносят первичные антитела (инкубация во влажной камере при температуре 37 °С в течение 60'). 12. Промывают срезы в PBS-буфере (или ТРИС-буфере) трижды по 7'. 13. На срезы наносят вторичные биотинилирован-ные антитела (инкубация во влажной камере при комнатной температуре в течение 30'). 14. Промывают срезы в PBS-буфере (или ТРИС-буфере) трижды по 7'. 94 к № 5, 2013 Таблица Протоколы проведения иммуногистохимического окрашивания парафиновых срезов биоптатов кожи больных атопическим дерматитом № п/п Протокол № 1 Протокол № 2 Протокол № 3 1. Депарафинация срезов Поместить срезы в термостат t°+56° на 30'. Депарафинация срезов Поместить срезы в термостат t°+56° на 30'. Депарафинация срезов 2. Регидратация срезов в дистиллированной воде Регидратация срезов в дистиллированной воде Регидратация срезов в дистиллированной воде, затем промывание в проточной воде 3. Демаскировка антигенных детерминант в цитратном буфере (рН 5,9-6,0) Демаскировка антигенных детерминант в цитратном буфере (рН 5,9-6,0) Пероксидазный блок 4. Пероксидазный блок Пероксидазный блок Промывание в буфере (ТРИС, рН 7,54-7,58 или PBS, рН 7,4-7,5) 5. Промывание в буфере (ТРИС, рН 7,54-7,58 или PBS, рН 7,4-7,5) Промывание в буфере (ТРИС, рН 7,54-7,58 или PBS, рН 7,4-7,5) Демаскировка антигенных детерминант в цитратном буфере (рН 5,9-6,0) 6. Нанесение на срезы первичных антител, инкубация во влажной камере при комнатной температуре (23-25 °С) в течение 60' Инкубация срезов с БСА (бычий сывороточный альбумин) для предотвращения неспецифического связывания антител Промывание в буфере (ТРИС, рН 7,54-7,58 или PBS, рН 7,4-7,5) 7. Промывание в буфере (ТРИС, рН 7,54-7,58 или PBS, рН 7,4-7,5) Нанесение на срезы первичных антител, инкубация во влажной камере при комнатной температуре (23-25 °С) в течение 60' Инкубация срезов с БСА (бычий сывороточный альбумин) для предотвращения неспецифического связывания антител 8. Нанесение на срезы вторичных антител, инкубация во влажной камере при комнатной температуре (23-25 °С) в течение 30' Промывание в буфере (ТРИС, рН 7,54-7,58 или PBS, рН 7,4-7,5) Нанесение на срезы первичных антител, инкубация во влажной камере при комнатной температуре (23-25 °С) в течение 60' 9. Промывание в буфере (ТРИС, рН 7,54-7,58 или PBS, рН 7,4-7,5) Нанесение на срезы вторичных антител, инкубация во влажной камере при комнатной температуре (23-25 °С) в течение 30' Промывание в буфере (ТРИС, рН 7,54-7,58 или PBS, рН 7,4-7,5) 10. Визуализация реакции (DAB-хромоген) Промывание в буфере (ТРИС, рН 7,54-7,58 или PBS, рН 7,4-7,5) Нанесение на срезы вторичных антител, инкубация во влажной камере при комнатной температуре (23-25 °С) в течение 30' 11. Докраска ядер гематоксилином Визуализация реакции (DAB-хромоген) Промывание в буфере (ТРИС, рН 7,54-7,58 или PBS, рН 7,4-7,5) 12. Заключение препаратов под покровное стекло Докраска ядер гематоксилином Визуализация реакции (DAB-хромоген) 13. Заключение препаратов под покровное стекло Докраска ядер гематоксилином 14. Заключение препаратов под покровное стекло 15. Приготовление рабочего раствора DAB-субстрата. 16. Проявление реакции (под контролем микроскопа) - на срезы нанести рабочий раствор DAB-субстрата, промыть дистиллированной водой. 17. Докраска ядер гематоксилином - срезы подсушить, нанести гематоксилин Майера (инкубация во влажной камере при комнатной температуре в течение 5'). 18. Промыть срезы дистиллированной водой дважды по 5'. 19. Для дегидратации стекла со срезами последовательно помещаются в следующие жидкости: ■ этиловый спирт 96% - 5'; ■ этиловый спирт 96% - 5'; ■ ксилол - 5'; ■ ксилол - 5'. 20. Заключение в монтирующую среду под покровное стекло. Основными проблемами при проведении реакции непрямой иммунофлюоресценции на замороженных срезах являлись потеря срезов при промывании в бу Вестник дерматологии и венерологии Научные исследования л 95 ферном растворе, а также неспецифическое фоновое окрашивание. В процессе тестирования протокола нРИФ тщательно отрабатывалась каждая ступень протокола. С целью достижения высокого качества имму-нофлуоресцентной окраски срезов некоторые стадии протокола также были оптимизированы: ■ во избежание потери срезов и лучшей их адгезии к предметному стеклу проводили их размораживание в течение 30' при комнатной температуре, не вынимая из фольги; ■ фиксацию срезов осуществляли, помещая их сначала в охлажденный раствор метанола в течение 10' при температуре (-20 °С), затем в охлажденный раствор ацетона в течение 2' при температуре (-20 °С). Указанные растворы предварительно охлаждали в течение 60' при температуре (-20 °С); ■ определено оптимальное рабочее разведение для всех концентрированных первичных антител -1:400. Также было отработано оптимальное время инкубации срезов с первичными антителами (60' в термостате при температуре +37°). ■ было увеличено время промывания срезов до 10'; отмывание срезов проводилось на шейкере. ■ для предотвращения эндогенной пероксидазной активности на срезы наносили 5% раствор бычьего сывороточного альбумина, оптимальное время инкубации составило 60' при комнатной температуре. Приводим протокол реакции непрямой иммунофлюоресценции, при котором были получены оптимальные результаты. 1. Приготовление буферного раствора для отмывания срезов в ходе реакции (фосфатный буфер, содержащий Tween20 (PBS) рН - 7,4-7,8). 2. Размораживание предметных стекол со срезами при комнатной температуре в течение 30 мин. 3. Фиксация в охлажденном растворе метанола при температуре (-20 °С) в течение 10 мин., затем в охлажденном растворе ацетона при температуре (-20 °С) в течение 2 мин. 4. Промывают срезы в PBS-буфере трижды по 5'. 5. На срезы наносят протеиновый блок - 5% раствор БСА, содержащий Tween20 (инкубация во влажной камере при комнатной температуре в течение 60). 6. На срезы наносят первичные антитела (инкубация во влажной камере при комнатной температуре в течение 60'). 7. Промывают срезы в PBS-буфере трижды по 10'. 8. На срезы наносят вторичные антитела, меченные флюоресцентным красителем (инкубация во влажной камере при комнатной температуре в течение 60). 9. Промывают срезы в PBS-буфере трижды по 10'. 10. Для докраски ядер наносят на срезы краситель DAPI. 11. Заключают препарат в реактив для заключения препаратов под покровное стекло. Результаты При анализе препаратов установлена высокая вариабельность экспрессии исследуемых нейропептидов. Экспрессия белка PGP9.5 наблюдалась на нервных волоконцах, присутствующих рядом с потовыми железами (рис. 1, а) и в составе сосудисто-нервных пучков (рис. 1, б), между гладкомышечными пучками мышцы, поднимающей волос (рис. 2, а) и в нервных стволиках, присутствующих в дерме (рис. 2, б); тонкие PGP9.5 позитивные нервные волоконца обнаруживались в сосочковом слое дермы (рис. 3, а, в), а также прорастали между кератиноцитами (рис. 3, б, г). Экспрессия белка амфирегулина (AR) выявлялась в эпидермисе в межклеточных промежутках (рис. 4, а, б, в, г). Экспрессия белка CGRP (рис. 5, а) и его рецептора cGRP-R (рис. 5, б) наблюдалась на нервных волоконцах, прорастающих между кератиноцитами. Реакция с Рис. 1. Экспрессия PGP9.5 в коже больного атопическим дерматитом, иммуногистохимическая реакция; а - рядом с потовой железой (х 200); б - в составе сосудисто-нервного пучка (х 200) 96 к № 5, 2013 Рис. 2. Экспрессия PGP9.5 в коже больного атопическим дерматитом. Иммуногистохимическая реакция: а - между гладкомышечными пучками мышцы, поднимающей волос (х 200); б - в нервном стволике (х 400) PGP9.5 в г Р 3 Экспрессия PGP9.5 в коже больного атопическим дерматитом. Иммуногистохимическая реакция: . а - в сосочках дермы (х 200); б - между кератиноцитами (х 400); в - в сосочках дермы (х 600); г - между кератиноцитами (х 600) моноклональными антителами к семафорину была отрицательной. Экспрессия фактора роста нервов (NGF) наблюдалась в цитоплазме кератиноцитов (рис. 6, а, б). Экспрессия вещества Р (SP) наблюдалась на нервных волоконцах, прорастающих между кератиноцита-ми (рис. 7, а, б). Экспрессия рецепторов к фактору роста нервов TrkA и к веществу Р (SP-R) выявлялась в эпидермисе на мембране кератиноцитов (рис. 8, а, б, в, г). Обсуждение Нейромедиаторы, к которым относятся нейропептиды и нейротрофины, были открыты как вещества, Вестник дерматологии и венерологии Научные исследования л 97 AR в г Рис. 4. Экспрессия амфирегулина (AR) в коже больного атопическим дерматитом. Иммуногистохимическая реакция (а - х 200; б - х 400); реакция непрямой иммунофлюоресценции (в - х 600; г - х 1000) ,,C“P О '■’j'S ■” ! мД 'Ш # V ; ^ * '1i4 ^ -* * *, v ШЛ f 1»Дй5«-* ' . * *. CGRP .^St >:■;■ sF; !»•**: ' -1-1’ , Г fc Tj • : '■ • . ■г;; , * ;/ ■ ; '^г'"i..*iu'ri. .«V!- Л б а Рис. 5. Экспрессия CGRP (а - х 200) и CRRP-R (б - х 400) в коже больного атопическим дерматитом (иммуногистохимическая реакция) 98 к № 5, 2013 NGF Рис. 6. Экспрессия фактора роста нервов (NGF) в коже больного атопическим дерматитом: а - иммуногистохи-мическое исследование (х 200); б - реакция непрямой иммунофлюоресценции (х 600) Рис. 7. Экспрессия субстанции Р (SP) в коже больного атопическим дерматитом. Иммуногистохимическая реакция (а - х 200; б - х 1000) которые образуются в нервной системе и влияют на ее функции. Однако в последующем оказалось, что источники и мишени для этих веществ не ограничиваются нервной системой. Со временем стало ясно, что продукция ФРН может происходить не только в нейронах, а сам нейро-трофин обладает рядом биологических эффектов на клетки, которые не являются нейронами. В настоящем исследовании обнаружено присутствие ФРН в цитоплазме кератиноцитов. Это согласуется с результа тами ранее проведенных исследований, показавших, что нормальные кератиноциты человека синтезируют и выделяют ФРН, который действует как фактор роста для этих клеток [9, 15, 16]. При этом ФРН в коже человека секретируется в больших количествах пролиферирующими кератиноцитами, тогда как в более дифференцированных клетках его продукция прекращается [15]. Показано, что кератиноциты экспрессируют высокоаффинный рецептор TrkA, с которым связывается Вестник дерматологии и венерологии Научные исследования л 99 TrkA Ч Ч| Г V г I : ^ to , '£ !* V'v & ^ S йВ * ^ t'sP-R? О ч<* * в б а г Экспрессия рецептора к фактору роста нервов (TrkA; а, б) и к субстанции Р (SP-R; в, г) в коже больного атопическим дерматитом: а, в - иммуногистохимическое исследование (х 400); б, г - реакция непрямой иммунофлюоресценции (х 600) ФРН [17]. Это подтверждается результатами настоящего исследования. С экспрессией TrkA кератиноцитами человека связывается способность ФРН индуцировать пролиферацию этих клеток [18]. Помимо ФРН в эпидермисе мышей была определена экспрессия амфирегулина [19]. Как и ФРН, ам-фирегулин способствует росту нервных волокон [20]. Тем самым он может повышать плотность иннервации кожи. В настоящем исследовании экспрессия амфирегулина была выявлена в межклеточных промежутках эпидермиса. Нейротрофины, в частности фактор роста нервов, считаются первыми идентифицированными нейротрофными факторами, поддерживающими рост и развитие чувствительных нейронов, которые распространяют свои дендриты в кожу, тем самым играя роль в иннервации кожи [21]. Известно, что в здоровой коже большинство С-волокон заканчивается в области дермально-эпидермального соединения и лишь немногие из них проникают в эпидермис [11, 22]. Прорастание нервных волокон в эпидермис между кератиноцитами у больных атопическим дерматитом, обнаруженное в настоящем исследовании, может быть следствием продукции ФРН и амфире-гулина. В то же время у обследованных пациентов не была выявлена экспрессия семафорина-3А. Ранее было показано, что это вещество может продуцироваться нормальными кератиноцитами эпидермиса [23, 24]. Семафорин-3А является антагонистом ФРН и препятствует разрастанию нервных волокон [11, 22]. Тем самым отсутствие экспрессии семафорина-3А является 100^ № 5, 2013 дополнительным фактором, способствующим росту нервных волокон. Чувствительные нервные С-волокна содержат нейропептиды, поэтому их разрастание сопряжено с повышением продукции нейропептидов, способных влиять на развитие и течение воспалительной реакции и способствовать развитию нейрогенного воспаления. Субстанция Р - нейропептид, который выделяется из чувствительных нервных окончаний, вызывая развитие или распространение воспалительной реакции [25]. Субстанция Р является одним из ключевых факторов в развитии нейрогенного воспаления в коже. Показано, что это вещество присутствует в дерме [26]. В настоящем исследовании у обследованных больных атопическим дерматитом присутствие субстанции Р было выявлено на нервных волокнах, прорастающих в эпидермис между кератиноцитами, на мембранах которых определялась экспрессия рецепторов к субстанции Р. С этими данными согласуются результаты ранее проведенных исследований, выявившие, что культивируемые кератиноциты эпидермиса и фибро-бласты экспрессируют рецептор субстанции Р NK-1R, а с помощью полимеразной цепной реакции в этих клетках была обнаружена мРНК белка NK-1R [27]. Показано, что при воздействии фактора роста нервов активированными Т-клетками и моноцитами мо жет продуцироваться CGRP [28, 29]. Считается, что cGRP опосредует различные антивоспалительные и иммуносупрессивные эффекты и, следовательно, может играть роль в нейроиммунологических взаимодействиях [30]. Источником большей части циркулирующего CGRP являются чувствительные нервные окончания [31]. В настоящем исследовании экспрессия cGRP и его рецептора cGRP-R была выявлена на нервных волокнах, прорастающих между кератиноцитами. Заключение Получены данные об экспрессии нейропептидов и нейротрофинов, способствующих разрастанию нервных волокон, а также развитию воспаления и возникновению зуда, в эпидермисе больных атопическим дерматитом. Обнаружено, что у больных атопическим дерматитом в эпидермис проникают нервные волокна, экспрессирующие нейропептиды субстанцию Р и CGRP, что может поддерживать у пациентов воспалительную реакцию и зуд. Способствовать росту нервных волокон и проникновению их в эпидермис может экспрессия факторов роста (фактора роста нервов и амфирегулина) на фоне отсутствия экспрессии семафорина-3А, подавляющего их рост

About the authors

O R KATUNINA

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology Ministry of Healthcare of the Russian Federation

V V CHIKIN

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: chikin@cnikvi.ru

L F ZNAMENSKAYA

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology Ministry of Healthcare of the Russian Federation

L A INOYATOVA

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology Ministry of Healthcare of the Russian Federation

References

Supplementary files