Methods for revealing therapeutic targets in case of true acantholytic pemphigus

Full Text

Истинная акантолитическая пузырчатка (ИАП) — группа аутоиммунных буллезных заболеваний кожи и/или слизистых оболочек, неотъемлемым, но не патогномоничным признаком которых является акантолиз, обусловленный формированием антител к компонентам межклеточной склеивающей субстанции эпидермиса. Несмотря на очень низкий показатель заболеваемости (от 0,08 до 1,6 на 100 000 населения в год), заболевание приводит к смерти больного в течение года в 4,8—54% случаев. Несмотря на существенный прогресс, достигнутый в лече нии ИАп в течение последних десятилетий, у ряда больных отмечается резистентность к традиционной иммуносупрессивной терапии, а длительный прием этих препаратов сопряжен с развитием тяжелых осложнений, приводящих к смерти пациентов. В связи с вышесказанным актуальным является поиск новых молекулярно-биологических мишеней для создания лекарственных средств, позволяющих снизить суммарную дозу кортикостероидов либо отказаться от их назначения. удовлетворить эту потребность клинической дерматологии могут фундаментальные ис © А.В. Миченко и соавт., 2012 Vestn Dermatol Venerol 2012; 5: 38—43. Контактная информация: michenko@cnikvi.ru Обзор литературы А 39 следования, направленные на изучение патогенеза ИАп, в том числе с применением новых лабораторных методов. С этой целью приведен обзор наиболее перспективных направлений и методов исследования патогенеза ИАп, потенциально способных выявить новые мишени для терапевтического воздействия. Изучение аутоантигенов при пузырчатке после обнаружения lgG-аутоантител у больных вульгарной [1] и листовидной [2] пузырчаткой проводились многочисленные исследования по выявлению антигенов, служащих мишенью для пемфигусных антител [3]. Для этих целей использовали сыворотку крови больных, выделенную фракцию иммуноглобулинов класса G и методом иммунопреципитации и имму-ноблоттинга оценивали их способность связываться с протеинами эпидермиса или культуры кератиноцитов, а также с мочой и слюной. Отдельные аутоантигены позволили выявить методы, обладающие низкой чувствительностью, в частности, флюорография с метаболически меченными белками кератиноцитов, предварительно адсорбированными сывороткой крови человека [4]. Однако более чувствительный, хотя и менее специфичный метод иммуноблоттинга позволил выявить десятки белков кератиноцитов, к которым образуются аутоантитела при пузырчатке [5]. В свою очередь, при помощи более чувствительного метода иммунопреципитации были определены антигены, как общие для вульгарной и листовидной пузырчатки, так и уникальные для каждого заболевания. В экспериментах с применением метода радиоиммунопреципитации была выявлена преципитация аутоантител ацетилхолиновыми рецепторами кератиноцитов [6], что положило начало изучению роли никотиновых и мускариновых рецепторов в патогенезе пузырчатки. В настоящее время известно, что оба типа рецепторов синергично регулируют адгезию клеток: при их блокировании наблюдается дезорганизация десмосом в результате фосфорилирования кадгеринов десмосом, в то время как применение холинергических агонистов предотвращает разрушение связи между клетками благодаря активации протеиновых фосфатаз и стимуляции экспрессии генов кадгеринов. Связывание пемфигусных антител с а9-субъеди-ницей ацетилхолиновых рецепторов подтверждалось также в экспериментах с блокированием иммунофлюоресценции, когда предварительная обработка препаратов пищевода обезьян сывороткой больных предотвращала иммунофлюоресценцию после нанесения кроличьих антител к а9-субъединице ацетилхолиновых рецепторов [7]. применение протеомных технологий позволило выявить связывание пемфигусных антител с а10-субъединицей ацетилхолиновых рецепторов, которая может быть частью пентамерного α9α10 никотинового ацетилхолинового рецептора [5]. В протеомных исследованиях также обнаружили связывание аутоантител при пузырчатке с М1, M2, M4 и M5 подтипами муска-риновых ацетилхолиновых рецепторов [8, 9]. Кроме того, антитела, элюированные из полосы с молекулярной массой 75 кД, фиксирующиеся в межклеточных пространствах эпидермиса и вызывающие акантолиз в монослое кератиноцитов, были подвергнуты тестированию с использованием библиотеки белков кера-тиноцитов, в результате чего был выявлен новый тип ацетилхолиновых рецепторов, названный пемфакси-ном [10]. Совсем недавно было описано выявление аутоантител к пилосебоцейным комплексам и к окружающим их сосудам и нервным волокнам у больных эндемической листовидной пузырчаткой [11]. Таким образом, в настоящее время благодаря применению широкого спектра методов было описано более пятидесяти аутоантигенов, к которым формируются аутоанитела при пузырчатке [5], что согласуется с гипотезой «множественного удара» [12]. Изучение аутоантител при пузырчатке поскольку развитие фармацевтической индустрии позволяет рассматривать антитела как мишень для терапевтического воздействия и создавать препараты, прицельно воздействующие на иммуноглобулины [13], патогенные аутоанитела при ИАп могли бы стать мишенью для терапевтического воздействия, в связи с чем их изучение представляет особый интерес. Для выделения патогенных аутоантител с целью их дальнейшего изучения использовались различные технологии. первые попытки синтеза патогенных аутоантител связаны с использованием мышиных и человеческих гетерогибридом, синтезирующих патогенные и непатогенные пемфигусные антитела [14—16]. Однако эта техника оказалась несовершенной с точки зрения определения спектра аутоантител, поскольку клеточные линии часто со временем теряли человеческие хромосомы [17]. Также предпринимались попытки синтезировать патогенные антитела к десмоглеину на модели пузырчатки у мышей, провоцируемой путем их активной иммунизации, при которой спле-ноциты мышей, не имеющих десмоглеин-3, пассивно переносились RAG-2-дефицитным мышам, экспрессирующим десмоглеин-3, что приводило к синтезу патогенных и непатогенных антител [18]. хотя некоторые мышиные антитела обладали патогенными свойствами в отношении человеческого десмоглеина-3, их нельзя использовать для разработки направленных методов лечения, поскольку они являются мышиными аллоантителами к мышиным десмоглеинам и неизвестно, насколько результаты исследования этих антител применимы к человеческим аутоантителам к десмоглеину у больных пузырчаткой. 40 к № 5, 2012 В последние годы в исследованиях патогенных аутоантител при пузырчатке нашел применение метод фагового дисплея, позволяющий характеризовать их патогенные свойства и генетические особенности. В 2009 г. J. Stanley и соавт. методом полимеразной цепной реакции клонировали вариабельную область тяжелой и легкой цепи периферических В-клеток и ввели их в вектор, входящий в состав фаговой частицы. В результате авторы получили фаговые частицы, содержащие кДНК, кодирующую патогенные аутоантитела, экспрессирующиеся на поверхности этих частиц. Библиотека фагов, полученных от больных вульгарной и листовидной пузырчаткой, для выделения клонов была отсортирована на панели, содержащей десмоглеины 1-го и 3-го типов. последовательность кДНК каждого клона была секвенирована. патогенные свойства моноклональных антител каждого полученного уникального клона оценивали либо путем введения в культуру кожи здорового человека, либо с использованием модели новорожденных мышей. В результате была выявлена выраженная рестрикция генов тяжелой цепи аутоантител, связывающих десмоглеин у больных и вульгарной, и листовидной пузырчаткой. полученные моноклональные антитела предлагается использовать для скринирования пептидных библиотек с целью поиска белков, блокирующих связывание аутоантител с аутоантигенами [19]. Изучение механизмов потери связи между кератиноцитами при пузырчатке В настоящее время известно, что в процессе нарушения межклеточных связей при пузырчатке участвует ряд механизмов, включающих активацию клеточных цитотоксических реакций, протеолитиче-ских ферментов, синтез провоспалительных и про-апоптотических цитокинов, однако наиболее обоснованным представляется действие пемфигусных аутоантител. В последние годы в ряде исследований был подтвержден факт активации внутриклеточных сигнальных путей при присоединении пемфигусных аутоантител к поверхности кератиноцита. Также было показано, что активация внутриклеточных сигнальных путей необходима для развития акантолиза. Так, в экспериментах с пассивным переносом пемфигусных IgG новорожденным мышам и использованием химических ингибиторов удалось подтвердить активацию ряда сигнальных эффекторов, способствующую развитию симптомов пузырчатки, в том числе рецептора эпидермального фактора роста, Myc, p38, plC/ pKC и Src [20—24]. Следует отметить, что основным методом исследования сигнальных путей является иммуногистохимическое окрашивание препаратов кожи с последующим микроскопическим исследованием. эти наблюдения свидетельствуют о том, что подавление специфических сигнальных путей может стать новым перспективным направлением лечения истинной акантолитической пузырчатки [25]. это предположение нашло поддержку в недавно проведенном исследовании киназы фокальной адгезии (КфА) — растворимой нерецепторной тирозин-киназы, экспрессирующейся почти всеми тканями и типами клеток и участвующей в ремоделировании цитоскелета, а также в образовании и дезорганизации структур, обеспечивающих адгезию клеток [26]. В эпидермисе и волосяных фолликулах мышей КфА локализуется преимущественно в области мембраны клеток. На модели пузырчатки у мышей M. Gil и соавт. (2012) продемонстрировали, что введение пемфигусных IgG приводит к повышению фосфо-рилирования КфА в области 397 и 925 тирозиновых остатков в базальном слое эпидермиса. при предварительном введении мышам ингибитора КфА акан-толиз в базальном слое эпидермиса отсутствовал. более того, наблюдалось уменьшение фосфорили-рования КфА (Y397/925) при введении ингибиторов изоформ рецептора эпидермального фактора роста, Src, mTOR и пан-каспаз перед введением пемфигусных igG. Кроме того, предварительное введение мышам ингибитора КфА перед инъекцией пемфигусных igG предотвращало изменение экспрессии Bax и Bcl-2, также как и повышение активности каспазы-9 и -3, индуцируемой пемфигусными igG. Наконец ингибиторы КфА уменьшали экспрессию фосфорили-рованных Src и mTOR в базальном слое эпидермиса. Таким образом, подтверждено участие фосфорили-рованной КфА (Y397/925) в развитии пузырчатки с вовлечением изоформ рецептора эпидермального фактора роста, Src и mTOR, что делает КфА потенциальной мишенью для терапевтического вмешательства при пузырчатке [27]. Результаты проведенного исследования согласуются с недавно предложенной С.А. Грандо концепцией апоптолиза как механизма потери связи клетками эпидермиса при пемфигусе, объединяющего активацию сигнальных путей пем-фигусными антителами и активацию апоптотических сигнальных путей [5]. Кроме того, следует отметить недавно проведенное исследование по валидизации новой модели акантолитической пузырчатки у мышей, получаемой путем пассивного переноса антител от больных пемфигусом взрослым 8-недельным мышам [28]. Данная модель была создана прицельно для изучения сигнальных путей при пемфигусе на модели заболевания у мышей, и ее преимуществом является завершенный морфогенез структур кожи в отличие от новорожденных мышей, позволяющий получать сопоставимые ультраструктурные, биохимические характеристики и параметры передачи сигналов внутри клеток с таковыми в культуре кожи больных пузырчаткой. Данная модель может использоваться для изучения переда- ■ Вестник дерматологии и венерологии Обзор литературы А 41 чи сигналов внутри клеток с участием десмоглеина-3, а также для изучения новых лекарственных средств. Изучение иммунорегуляторных механизмов при пузырчатке Для изучения клеточных механизмов регуляции аутоиммунных реакций у больных пузырчаткой проводятся как сравнительные исследования свойств иммунных клеток у больных пузырчаткой и здоровых добровольцев, так и исследования с применением различных моделей заболевания у мышей. В настоящее время известно, что потеря толерантности к собственным антигенам (десмоглеину-3) одновременно В- и Т-лимфоцитами является необходимым условием для индукции достаточного образования igG к десмоглеину-3 [29]. Однако механизмы потери толерантности к аутоантигенам в настоящее время изучены недостаточно. Несмотря на то что цитоток-сические Т-клетки, сенсибилизированные в отношении антигенов кератиноцитов, выявляются у больных пузырчаткой [30], сенсибилизированные к десмоглеи-ну-3 Т-хелперы (Th) 1-го и 2-го типов, а также В-клетки обнаруживаются и у здоровых добровольцев, что подтверждается образованием аутореактивных антител к десмоглеину-3 у здоровых родственников больных пузырчаткой [31, 32]. при этом у здоровых носителей аллелей HLA ii класса, ассоциированных с развитием пузырчатки, отмечается преобладание Т1і1, сенсибилизированных к десмоглеину-3, а у больных пузырчаткой — Т1і2, сенсибилизированных к десмоглеину-3 [33]. Аналогично, Th1 и Th2, сенсибилизированные к десмоглеину-1, обнаруживаются у больных пузырчаткой и здоровых добровольцев [34]. поэтому предполагается, что в реализации аутоиммунных реакций при пузырчатке, как и при ряде других дерматозов, одну из ключевых ролей играют супрессорные (регуляторные) лимфоциты (Treg), по-видимому, активно подавляющие аутоиммунные реакции у носителей аутореактивных Т-лимфоцитов. Возможно, что основным этапом инициации акантолитической пузырчатки является дисбаланс между аутореактивными Th и Treg [35]. это предположение подтверждается обнаружением снижения уровня Treg в крови больных пузырчаткой [36]. Однако присутствие Treg в очагах поражения у больных акантолитической пузырчаткой может свидетельствовать о перераспределении этих клеток с накоплением их в коже и регионарных лимфатических узлах [37]. Для уточнения роли каждой из клеток в патогенезе ИАп необходимы дальнейшие исследования взаимодействия Treg, Th1, Th2 и Th17. Для понимания механизмов взаимодействия регуляторных и эффекторных клеток иммунной системы и механизмов индукции синтеза аутоантител большое значение имеют экспериментальные исследования по созданию моделей ИАп у лабораторных животных. Впервые модель акантолитической пузырчатки у мышей была предложена в 1982 г. G. Anhalt и соавт. [38], наблюдавшими формирование пузырей и эрозий у новорожденных лабораторных мышей инбредной линии BALB/с после пассивного переноса антител от больных вульгарной пузырчаткой. при этом гистологические, ультраструктурные признаки и результаты иммунофлюоресцентного окрашивания препаратов кожи мышей полностью повторяли таковые у больных ИАп, а титры циркулирующих антител коррелировали со степенью тяжести клинической картины. Такую модель называют моделью «пассивного» заболевания, поскольку ее развитие у мышей связано с пассивным переносом антител. эти эксперименты позволили определить ключевую роль igG в патогенезе пузырчатки, однако в настоящее время для изучения клеточных механизмов ведутся работы по созданию модели «активного» заболевания, т. е. индукции пемфигуса у мышей без переноса антител больных пузырчаткой. поскольку непосредственная иммунизация мышей рекомбинантным десмоглеином-3 не приводит к развитию акантолиза в коже, несмотря на явный синтез антител [39—41], исследователи использовали различные подходы для развития аутоиммунной реакции с формированием развернутой клинической картины пузырчатки. Так, была получена модель активного заболевания у мышей после трансплантации Rag2-/- иммунодефицитным мышам, экспрессирующим десмоглеин-3, клеток селезенки, продуцирующих антитела к десмоглеину-3, от иммунизированных рекомбинантным десмоглеином нокаутных Dsg3-/- мышей [42] либо от наивных Dsg3-/- мышей [43]. почти у 20% этих мышей отмечалось развитие акантолиза и эрозий на слизистой оболочке полости рта. Несмотря на то что процесс потери связи между кератиноцитами в коже мышей и в коже больных различается, эта модель пузырчатки может использоваться для изучения регуляции адаптивного иммунного ответа на десмоглеин-3. Также была создана модель трансгенных мышей (Dsg3h1-TCR Tg), у которых рецепторы Т-клеток приобретали способность распознавать определенные пептидные участки десмоглеина. Для этого Dsg3h1-TCR Tg мышь скрестили с иммунодефицитной (Rag2-/-) мышью для получения мыши, у которой все Т-клетки были бы специфичны в отношении десмоглеина. Клетки костного мозга этой мыши перенесли нокаут-ной мыши (Dsg3-/-), не экспрессирующей десмоглеин, после чего трансгенные Т-клетки, специфичные в отношении десмоглеина-3, выявлялись в периферических лимфоидных органах. Следует отметить, что пришлось прибегнуть к этой сложной схеме создания модели заболевания, поскольку при перенесении данных клеток дикому типу мышей клетки разрушались в тимусе и не выявлялись в периферических лимфо 42 к № 5, 2012 идных органах. эта модель позволяет изучать механизмы центральной и периферической толерантности к физиологическим эпидермальным аутоантигенам и патогенез аутоиммунных реакций [44]. Таким образом, в настоящее время применяются новые методы исследования патогенеза ИАп, созда ются более совершенные модели заболевания, позволяющие выявлять разнообразные потенциальные терапевтические мишени, что стимулирует дальнейшие исследования данной проблемы и может способствовать формированию перспективных подходов к лечению этого летального дерматоза.

About the authors

A V MICHENKO

Email: michenko@cnikvi.ru

L F ZNAMENSKAYA

A N LVOV

S V ROTANOV

I A VOLKOV

O R KATUNINA

References

Supplementary files