Vestnik dermatologii i venerologiiVestnik dermatologii i venerologiiВестник дерматологии и венерологии0042-46092313-6294Rossijskoe Obschestvo Dermatovenerologov i Kosmetologov52910.25208/0042-4609-2019-95-6-22-28ORIGINAL STUDIESНАУЧНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯCoamplification of Mycobacterium leprae genome sections by real-time PCR: Detection of the pathogen and the possibility of a semi-quantitative assessment of the bacterial loadКоамплификация участков генома Mycobacterium leprae методом ПЦР в реальном времени: обнаружение возбудителя и возможность полуколичественной оценки бактериальной нагрузкиhttps://orcid.org/0000-0002-1104-7694VerbenkoD. A.ВербенкоД. А.
Russian Federation

Cand. Sci. (Biol.), Acting Head, Department of the Laboratory Diagnostics of STIs and Dermatoses

Korolenko str., 3, bldg 6, Moscow, 107076, Russian Federation

к.б.н., и. о. заведующего отделом лабораторной диагностики ИППП и дерматозов 107076, Российская Федерация, г. Москва, ул. Короленко, д. 3, стр. 6

verbenko@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0003-3805-8489KaramovaA. E.КарамоваА. Э.
Russian Federation

Cand. Sci. (Med)., Head of the Department of Dermatology

Korolenko str., 3, bldg 6, Moscow, 107076, Russian Federation

к.м.н., заведующий отделом дерматологии 107076, Российская Федерация, г. Москва, ул. Короленко, д. 3, стр. 6

https://orcid.org/0000-0002-6841-8599SolomkaV. S.СоломкаВ. С.
Russian Federation

Dr. Sci. (Biol.), Deputy Director for Research

Korolenko str., 3, bldg 6, Moscow, 107076, Russian Federation

д.б.н., заместитель директора по научной работе 107076, Российская Федерация, г. Москва, ул. Короленко, д. 3, стр. 6

https://orcid.org/0000-0002-7625-0503KubanovA. A.КубановА. А.
Russian Federation

Dr. Sci. (Med.), Prof., Corresponding Member of the Russian Academy of Sciences, Acting Director

Korolenko str., 3, bldg 6, Moscow, 107076, Russian Federation

д.м.н., профессор, член-корреспондент РАН, и. о. директора 

107076, Российская Федерация, г. Москва, ул. Короленко, д. 3, стр. 6

https://orcid.org/0000-0002-2495-6694DeryabinD. G.ДерябинД. Г.
Russian Federation

Dr. Sci. (Biol.), Leading Researcher, Department of the Laboratory Diagnostics of STIs and Dermatoses

Korolenko str., 3, bldg 6, Moscow, 107076, Russian Federation

д.б.н., ведущий научный сотрудник отдела лабораторной диагностики ИППП и дерматозов 107076, Российская Федерация, г. Москва, ул. Короленко, д. 3, стр. 6

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology, Ministry of Health of the Russian FederationГосударственный научный центр дерматовенерологии и косметологии Министерства здравоохранения Российской ФедерацииState Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology, Ministry of Health of the Russian FederationГосударственный научный центр дерматовенерологии и косметологии Министерства здравоохранения Российской Федерации 107076, Российская Федерация, г. Москва, ул. Короленко, д. 3, стр. 62612201995622282601202026012020Copyright ©; 2019, Verbenko D.A., Karamova A.E., Solomka V.S., Kubanov A.A., Deryabin D.G.Copyright ©; 2019, Вербенко Д.А., Карамова А.Э., Соломка В.С., Кубанов А.А., Дерябин Д.Г.2019Verbenko D.A., Karamova A.E., Solomka V.S., Kubanov A.A., Deryabin D.G.Вербенко Д.А., Карамова А.Э., Соломка В.С., Кубанов А.А., Дерябин Д.Г.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://vestnikdv.ru/jour/article/view/529

Aim. To develop a method for coamplification of single-copy genes and repetitive elements of the Mycobacterium leprae genome in the analysis of clinical material from leprosy patients with an assessment of the clinical significance of the study results.Materials and methods. Skin scarification and biopsy samples from patient R. with a diagnosis of “A30.5 Leprosy. Multibacillary form. Lepromatous type. Active stage” were used as empirical material for the study. A search for M. leprae DNA in the clinical material was performed by the method of real-time PCR (RT-PCR) using primers and hydrolysis probes for the single-copy species-specific genes rpoB (encodes the β-subunit of bacterial RNA polymerase), sodA (encodes the superoxide dismutase enzyme) and mntH (encodes the manganese transport protein), as well as for RLEP — the non-coding repetitive element of the genome.Results. Using various RT-PCR assays, consistent results were obtained concerning the presence or absence of M. leprae DNA in the studied clinical samples. The high sensitivity of PCR was confirmed for the detection of the repetitive element RLEP compared to the single-copy genes rpoB, sodA and mntH, which consists in reducing the number of amplification cycles (Ct) needed for exceeding the threshold fluorescence value of hydrolysis probes and leading to the maximum intensity of the fluorescence signal. When constructing standard graphs for calibrating the accumulation of a fluorescent signal for simultaneously analyzed portions of the M. leprae genome in dilutions from 1 to 1,000, significant differences in the results of co-amplification were noted depending on the quantitative presence of the DNA being detected.Conclusion. Coamplification of M. leprae genome sections with varying degrees of copy number variation by the RTPCR method provides for effective detection of the M. leprae DNA in clinical material and forms a basis for a quantitative assessment of the bacterial load in skin scarification and biopsy samples.

Цель исследования. Разработка метода коамплификации однокопийных генов и повторяющихся элементов генома Mycobacterium leprae при анализе клинического материала от больных лепрой с оценкой клинической значимости результатов подобного исследования.Материалы и методы. Материалом для исследования явились образцы скарификатов и биоптатов кожи от больной Р. с диагнозом «А30.5 Лепра. Мультибациллярная форма. Лепроматозный тип. Активная стадия». Поиск ДНК M. leprae в клиническом материале проводили методом ПЦР в реальном времени (РТ-ПЦР) с использованием праймеров и гидролизуемых зондов к однокопийным видоспецифичным генам rpoB (кодирует β-субъединицу бактериальной РНК-полимеразы), sodA (кодирует фермент супероксиддисмутазу) и mntH (кодирует белок марганцевый транспортер), а также некодирующему многокопийному элементу генома — RLEP.Результаты. С использованием различных вариантов РТ-ПЦР получен согласующийся результат о присутствии или отсутствии ДНК M. leprae в отдельных исследованных клинических образцах. Подтверждена высокая чувствительность ПЦР-детекции многокопийного элемента генома RLEP в сравнении с однокопийными генами rpoB, sodA и mntH, заключающаяся в уменьшении количества циклов амплификации (Ct), необходимых для превышения порогового уровня флуоресценции гидролизующихся зондов, и приводящая к максимальной интенсивности сигнала флуоресценции. При построении стандартных графиков калибровки накопления флуоресцентного сигнала к одновременно анализируемым участкам генома M. leprae в разведениях от 1 до 1000 продемонстрированы четкие различия результатов коамплификации в зависимости от количественного присутствия детектируемой ДНК.Выводы. Коамплификация участков генома M.leprae с разной степенью копийности методом РТ-ПЦР обеспечивает эффективную детекцию ДНК возбудителя лепры в клиническом материале и формирует основу для полуколичественной оценки бактериальной нагрузки в кожных биоптатах и скарификатах.

Mycobacterium lepraeleprosylaboratory diagnosticsRT-PCRsodAmntHrpoBRLEPMycobacterium lepraeлепралабораторная диагностикаРТ-ПЦРsodAmntHrpoBRLEP1. Fischer M. Leprosy — an overview of clinical features, diagnosis, and treatment. J Dutsch Dermatol Ges. 2017;15(8):801–827.2. Ridley D. S., Jopling W. H. Classification of leprosy according to immunity. A five-group system. Int J Lepr Other Mycobact Dis. 1966;34(3):255–273.3. МКБ 10 — Международная классификация болезней 10-го пересмотра. Версия: 2019. https://mkb-10.com/index.php?pid=1744. World Health Organization. Regional Office for South-East Asia, Global Leprosy Programme. Global leprosy strategy 2016–2020: monitoring and evaluation guide accelerating towards a leprosy-free world. New Delhi: WHO Regional Office for South East Asia; 2017. http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/254907/97892902254925. Образцова О. А. Молекулярно-биологические методы исследования в лабораторной диагностике лепры: эпидемиологический анализ, генетические детерминанты резистентности к антимикробным препаратам. Вестник дерматологии и венерологии. 2017;6:34–40.6. Cho S. N., Yanagihara D. L., Hunter S. W., Gelber R.H., Brennan P. J. Serological specificity of phenolic glycolipid 1 from M. leprae and use in serodiagnosis of leprosy. Infect Immun. 1983;41(3):1077–1083.7. Duthie M. S., Balagon M. F., Maghanoy A., Orcullo F. M., Cang M., Dias R. F. et al. Rapid quantitative serological test for detection of infection with Mycobacterium leprae, the causative agent of leprosy. J Clin Microbiol. 2014:52(2):613–619.8. Fujiwara T., Hunter S. W., Cho S. N., Aspinall G. O., Brennan P. J. Chemical synthesis and serology of the disaccharides and trisaccharides of phenolic glycolipid antigen from leprosy bacillus and preparation of a disaccharide protein conjugate for serodiagnosis of leprosy. Infect Immun. 1984;43(1):245–252.9. Santos A. R., De Miranda A. B., Sarno E. N., Suffys P. N., Degrave W. M. Use of PCR-mediated amplification of Mycobacterium leprae DNA in different types of clinical samples for the diagnosis of leprosy. J Med Microbiol. 1993;39(4):298–304.10. Martinez A. N., Talhari C., Moraes M. O., Talhari S. PCR-based techniques for leprosy diagnosis. From the laboratory to the clinic. PLoS Negl Trop Dis. 2014;8(4):e2655. DOI: 10.1371/journal.pntd.000265511. Pathak V. K., Singh I., Turankar R. P., Lavania M., Ahuja M., Singh V. et al. Utility of multiplex PCR for early diagnosis and household contact surveillance for leprosy. Diagn Microbiol Infect Dis. 2019;95(3):114855. DOI: 10.1016/j.diagmicrobio.2019.06.007812. Turankar R. P., Pandey S., Lavania M., Singh I., Nigam A., Darlong J. et al. Comparative evaluation of PCR amplification of RLEP, 16S rRNA, rpoT and SodA gene targets for detection of Mycobacterium leprae DNA from clinical and environmental samples. Int J Mycobacteriol. 2015;4(1):54–59.13. Azevedo M. C., Ramuno N. M., Fachin L. R., Tassa M., Rosa P. S., Belone A. F. et al. qPCR detection of Mycobacterium leprae in biopsies and slit skin smear of different leprosy clinical forms. Braz J Infect Dis. 2017;21(1):71–78. DOI: 10.1016/j.bjid.2016.09.01714. Образцова О. А., Вербенко Д. А., Карамова А. Э., Семенова В. Г., Кубанов А. А., Дерябин Д. Г. Совершенствование ПЦР-диагностики лепры путем амплификации видоспецифичного повторяющегося фрагмента генома Mycobacterium leprae. Клиническая лабораторная диагностика. 2018;63(8):511–516. DOI: 10.18821/0869-2084-2018-63-8-511-51615. Woods S. A., Cole S. T. A family of dispersed repeats in Mycobactenium leprae. Mol Microbiol. 1990;4:1745–1751.16. Martinez A. N., Lahiri R., Pittman T. L., Scollard D., Truman R., Moraes M.O. et al. Molecular determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR. J Clin Microbiol. 2009;47(7):2124–2130.17. Chaitanya V. S., Cuello L., Das M., Sudharsan A., Ganesan P., Kanmani K. et al. Analysis of a novel multiplex polymerase chain reaction assay as a sensitive tool for the diagnosis of indeterminate and tuberculoid forms of leprosy. Int J Mycobacteriol. 2017;6(1):1–8.18. Banerjee S., Sarkar K., Gupta S., Mahapatra P. S., Gupta S., Guha S. et al. Multiplex PCR technique could be an alternative approach for early detection of leprosy among close contacts: a pilot study from India. BMC Infect Dis. 2010;10:252.