Bioinformatic analysis of T. pallidum specific antigens

Abstract


Using bioinformatics methods (PSI-BLAST, PSORTb, Cello, BOMP, TMBETADISC-PSSM, TMHMM, LipoP, UiB Lipo, SignalP servers), the authors analyzed sequences of fifteen T. pallidum proteins, which may be potential antigens for the diagnostics of the syphilitic infection. They revealed that Tp0259, Tp0453, Tp0608, Tp0326, Tp0249, Tp0136 and Tp0684 proteins may be promising for further studies.

Full Text

Работа выполнена в рамках государственного задания Министерства здравоохранения Российской федерации фГБу «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии» на период 2012—2014 гг. Раздел 1. Выполнение фундаментальных научных исследований. Наименование государственной работы: «Изучение генетической вариабельности возбудителей инфекций, передаваемых половым путем, циркулирующих на территории Российской федерации», наименование работы «поиск новых диагностически значимых антигенов возбудителя сифилитической инфекции» (Государственный контракт № 114/Бу-2012-051 от 16.01.2012). В настоящее время основным методом лабораторного исследования для выявления больных сифилисом является определение в крови обследуемых специфических антител к антигенам возбудителя заболевания Treponema pallidum [1—5]. Антитела выявляются различными иммунохимическими (серологическими) методами (иммуноферментный, иммуно-хемилюминесцентный, иммунохроматографический анализы, линейный иммуноблоттинг, исследование с применением проточной флюорометрии, технология иммуночипов); при этом в качестве наиболее специфических антигенов в составе наборов реагентов используются рекомбинантные аналоги антигенов T. pallidum: TpN15 (Tp0171), TpN17 (Tp0435), TpN47 (Tp0574), TpN44,5 (TmpA, Tp0768) [6, 7]. Иммунологические тесты, основанные на использовании вышеперечисленных антигенов, применяются как для первичного выявления больных сифилисом при обследовании различных контингентов населения, © С.В. Ротанов и соавт., 2012 Vestn Dermatol Venerol 2012; 5: 56—64. Контактная информация: rotanov@cnikvi.ru Научные исследования А 57 так и для оценки состояния гуморального иммунного ответа у больных с активными формами инфекции и у пациентов, получивших специфическую антибактериальную терапию и находящихся под клинико-серологическим наблюдением [2, 8]; при этом ограниченный набор антигенов T. pallidum, входящих в состав иммуносорбента, не позволяет во всех случаях своевременно выявлять сифилитическую инфекцию [9]. Диагностикумы, применяемые для выполнения иммунохимических методов исследования, как правило, обладают высокой клинической чувствительностью (97—99,7%), но не дают 100% клинической специфичности, что в существенной степени зависит от используемого производителями состава антигенов T. pallidum. Ряд исследователей указывает на частую регистрацию ложноположительных результатов в трепонемных исследованиях для выявления сифилиса у пациентов с воспалительными заболеваниями периодонта за счет определения у них антител к антигенам TpN17 и TpN47 [10]. указанное явление свидетельствует о недостаточной специфичности используемых для исследования антигенов ввиду их им-муногенной близости с антигенами микроорганизмов, вызывающих воспалительные изменения периодонта, в том числе и трепонем-комменсалов. при разных клинических формах и стадиях заболевания показатели эффективности иммунологических исследований для диагностики сифилиса могут существенно различаться [11], что может быть связано с различиями в уровне экспрессии отдельных антигенов T. pallidum и их доступности для иммунной системы больного. Все это вызывает необходимость поиска новых специфических антигенов T. pallidum, которые обладали бы высокой иммуногенностью и позволяли с высокой достоверностью устанавливать диагноз сифилиса на разных, в том числе ранних, стадиях инфекции. Наибольший интерес для поиска новых антигенов T. pallidum представляют белки цитоплазматической и наружной мембраны, так как именно они в первую очередь являются мишенями для иммунной системы организма хозяина [12]. На экспериментальных животных моделях было показано, что антитела к белкам наружной мембраны играют важную роль в элиминации возбудителя из макроорганизма [13]. В то же время известно, что наибольшей иммуногенностью обладают липопротеины, локализующиеся на цитоплазматической мембране со стороны периплазмы, ввиду содержания в их структуре высокоиммуноген-ных радикалов жирных кислот [14—16]. К настоящему времени известна структура генома T. pallidum, представленного 1090 генами, 1039 из которых кодируют белки [17]. Однако иммунологические и физико-химические свойства большинства белков, входящих в структуру T. pallidum, долгое время оставались недостаточно изученными в связи с невоз можностью длительного культивирования патогенных штаммов T. pallidum на искусственных средах. Широкомасштабное изучение белкового состава различных организмов, в том числе и возбудителя сифилиса, стало возможным благодаря развитию методов протеомики. С использованием протеомных методов исследования было выявлено и охарактеризовано более сотни новых иммуногенных белков T. pallidum, что существенно расширило знания об антигенной структуре микроорганизма [14, 15, 18]. Целью настоящего исследования явилось определение специфических антигенов T. pallidum для разработки новых высокоинформативных методов диагностики сифилиса на основе анализа опубликованных результатов протеомных исследований T. pallidum и использования методов биоинформатики. Материал и методы Выявление новых антигенов T. pallidum проводилось на основе сравнительного анализа данных, полученных в ходе выполнения протеомных исследований по серологическому скринингу и определению иммунной активности компонентов рекомбинантных экспрессионных библиотек [14] и нативных белков T. pallidum, разделенных методом двумерного электрофореза [15]. Отобранные на основании данных литературы антигены T. pallidum были дополнительно исследованы и охарактеризованы с использованием методов биоинформатики, целью которых являлось изучение свойств отобранных для изучения белков, в частности, определение аминокислотной последовательности белков, выявление сайтов липидирования, определение клеточной локализации, а также установление специфичности белков для рода Treponema, что играет важную роль при выборе антигенов для диагностических методов исследования. Аминокислотные последовательности белков возбудителя сифилиса, соответствующие открытым рамкам считывания ДНК бактериальной хромосомы T. pallidum, были получены из депозитария Национального центра биотехнологической информации (Бетес-да, США), содержащего последовательности полных геномов более чем 1000 микроорганизмов [19]. Для определения сходства аминокислотной последовательности отобранных белков с белками других микроорганизмов проводили поиск гомологии их первичной структуры против невырожденной базы белковых последовательностей NCBInr методами blastp и pSI-BLAST [20] (с применением статистического критерия значимости E-value < 10-3 и матрицы замен аминокислотных остатков BLOSUM62). Для выявления липопротеинов, закодированных в геноме T. pallidum, проводился анализ с помощью серверов UiB Lipo [21] и LipoP [22]. принцип работы указанных программ основан на распознавании так 58 к № 5, 2012 называемых липо-боксов — участков в последовательности полипептида, узнаваемых сигнальной пептидазой ii типа. Для установления клеточной локализации отобранных белков использовали серверы pSORTb 3.0.2 [23] и Cello [24], представляющие собой программы для предсказания локализации белков с использованием математических расчетов, основанных на байесовских сетях и методе опорных векторов соответственно. В данных серверах реализован конвейерный подход анализа последовательностей белков с поиском гомологии с другими бактериальными белками, обнаружением специфических аминокислотных мотивов, профиля гидрофобности, сайтов распознавания сигнальными пептидазами. Важным элементом определения локализации белков является анализ наличия в их структуре трансмембранных альфа-спиральных областей, сигнальной последовательности (сигнального пептида) и бета-складчатых участков. Выявление трансмембранных альфа-спиральных областей белков проводили с помощью программы TMHMM Server v. 2.0. В данной программе альфа-спиральная топология участков белка предсказывается путем расчетов, проводимых на основе скрытых моделей Маркова, исходя из вероятностей нахождения аминокислотных остатков в различных сегментах белка (в трансмембранных, в цитоплазматической части и т. д.) и длины известных трансмембранных областей белков [25]. Наличие сигнального пептида у предшественников белков устанавливали с помощью сервера Signalp 4.0 [26]; структура сигнального пептида и сайт его расщепления предсказываются на основании оценки аминокислотной последовательности белка с использованием нейронных сетей. Выявление бета-складчатых участков проводили с помощью серверов BOMp [27] и TMBETADiSC-pSSM [28]. Для идентификации специфичности белков для рода Treponema применяли поиск геномной информации о возбудителях инфекций, передаваемых половым путем, по базе данных Национальной лаборатории Лос-Аламоса (США), которая содержит информацию о белках T. pallidum с Tp0001 по Tp1041 [29]. Результаты и их обсуждение Дизайн исследования включал несколько этапов. На первом этапе работы по выявлению новых специфических антигенов T. pallidum были проанализированы результаты исследований иммунопротеома T. pallidum, проведенных с использованием двух про-теомных платформ: при серологическом скрининге библиотеки рекомбинантных белков T. pallidum, осуществленном М. Brinkman и соавт. [14], и серологическом скрининге нативных белков, разделенных ме тодом двумерного электрофореза, представленном в работе М. McGill и соавт. [15]. Из большого количества иммуногенных полипептидов T. pallidum (рис. 1, a, б), изучавшихся в вышеуказанных работах, нами были отобраны белки, серологическая реактивность (иммуногенность) которых в отношении человеческой сыворотки была подтверждена обеими протеомными платформами (рис. 1, в). Среди 9 выявленных иммуногенных белков выделено 3 белковых антигена T. pallidum, которые широко используются в составе иммуносорбентов в современных наборах реагентов для иммуноферментных исследований: Tp0435 (TpN17), Tp0574 (TpN47), Tp0768 (TmpA, TpN44,5), в связи с чем они были исключены из дальнейшего исследования. Оставшиеся 6 белков были подвергнуты дальнейшему анализу. В список потенциальных антигенов T. pallidum, отобранных для дальнейшего исследования, дополнительно были включены 9 белков, в том числе 7 белков, для которых описана экспрессия в клетках T. pallidum и выявлена иммуногенность в отношении сыворотки крови больных сифилисом на различных стадиях инфекционного процесса (Tp0108, Tp0249, Tp0259, Tp0453, Tp0608, Tp0886 и Tp0965 (см. рис. 1, б), а также еще 2 белка: Tp0136 и Tp0326 (см. рис. 1, а). Выбор белка Tp0326 был обусловлен тем, что это единственный белок T. palladium, гомологичный известным белкам наружной мембраны других грамотрицательных микроорганизмов; для белка Tp0136 описана способность к связыванию человеческим фибронектином, что свидетельствует о возможности его участия во взаимодействии микроорганизма с внеклеточным матриксом человека и важной роли в патогенезе сифилиса. Таким образом, на основе изучения результатов серологического скрининга для дальнейшего исследования нами было отобрано 15 белков T. pallidum (табл. 1). На следующем этапе работы было проведено изучение свойств отобранных белков T. pallidum путем биоинформатического анализа их аминокислотных последовательностей. Для выявления новых диагностически значимых антигенов T. pallidum учитывались следующие характеристики белков: ш наличие в составе белка липидных остатков (сайтов липидирования); ш расположение белка в клетке; ш специфичность для рода Treponema. Для повышения точности предсказания свойств антигенов применяли комбинированное исследование последовательности белков с использованием нескольких программ. Анализ сайтов липидирования. Важной характеристикой бактериальных антигенов является наличие в составе их молекулы остатков жирных кислот. пока- ■ Вестник дерматологии и венерологии Научные исследования л 59 Tp0767 Tp0398 Tp0463 Tp0470 Tp0486 Tp0772 Tp0974 Tp0625 Tp0789 Tp0663 Tp0327 Tp0257 Tp0693 Tp0327 tp0727 Tpoi36 Tp0277 Tp0750 Tp0277 Tp0821 Tp0225 Tp0292 Tp0954 Tp0292 Tp0956 Tp0326 t плсо Tp0605 6 TP045TP0349 Tp0030 IpU34Tb0400 Tp0870 Tp012T2p0400Tp0259 Tp°°56 Tp050L Tp0886 Tp0748 TP0509 Tp0365 Tp0844 Tp0094 Tp0965 Tp0862 Tp0584 Tp0608 Tp0921 Tp0115 Tp0108 Tp0925 Tp0171 Tp0747 Tp0249 Рис. 1. Белки T. pallidum, иммунореактивные в отношении сыворотки крови больных сифилисом: а — по данным серологического скрининга рекомбинантных экспрессионных библиотек T. pallidum (Brinkman М. и соавт.); 6 — по данным серологического скрининга нативных белков T. pallidum (McGill М. и соавт.); в — белки, проявившие иммуногенные свойства в обоих протеомных методах (полужирным шрифтом отмечены белки, отобранные для дальнейшего изучения; подчеркнуты белки, широко применяемые в современных коммерческих наборах реагентов для диагностики сифилиса) I ТАБЛИЦА 1 Список белков T. pallidum, отобранных для биоинформатического анализа № п/п № ОРС № по базе данных GenBank Предполагаемая функция или локализация белка 1 TP0163* 3322289 ABC переносчик (TroA) 2 TP0216* NP_218656.1*** Молекулярный шаперон DnaK 3 TP0684* 3322834 Глюкозо/галактозосвязывающий белок (MglB-2) 4 TP0769* 3322751 Белок внешней мембраны (TmpB) 5 TP0971* NP_219408.1 Лактоферрин-связывающий белок (Tp34, TpD) 6 TP1038* NP_219475.1*** Олигомерная форма бактериоферритина (TpF1, антиген c1-5, 4D) 7 Tp0108** 3322371 6-фосфофруктокиназа 8 Tp0136** 3322413 Гипотетический белок 9 Tp0249** NP_218689.1 Белок флагеллярных филаментов (FlaA1) 10 Tp0259** 3322536 Мембранный липопротеин TpE 11 Tp0326** 3322602 Белок внешней мембраны 12 Tp0453** NP_218894.1 Гипотетический белок TP0453 13 Tp0608** 3322905 Гипотетический белок TP0608 14 Tp0886** 3323203 Полинуклеотидфосфорилаза (Pnp) 15 Tp0965** 3323286 Предполагаемый мембранный белок Примечания. * Белки, для которых показана иммунореактивность в обоих использованных протеомных методах [14, 15]. ** Белки, которые выявлялись лишь в одном из методов протеомных исследований, но для которых показана иммуногенность в других работах. *** ОРС — открытая рамка считывания (номер в базе данных NCBI Reference Sequence). 60 L № 5, 2012 зано, что липидные остатки в составе липопротеинов служат своеобразными адъювантами, значительно усиливающими иммунный ответ организма хозяина [16]. Для предсказания сайтов липидирования изучавшихся белков нами были использованы программы Lipop и UiB Lipo. Выявление сайтов липидирования (липо-боксов) 15 отобранных белков в программе Lipop показало, что характерными участками модификации жирнокислотных радикалов обладали 6 белков T. pallidum (табл. 2), однако сервер UiB Lipo смог определить наличие сайтов липидирования только в 4 из них. Для верификации полученных результатов была проведена визуальная проверка и ручная обработка последо вательности белков, определенных программой Lipop как липопротеины (рис. 2). проведенная обработка данных позволила установить, что N-концевые участки этих белков содержат аминокислотный мотив, характерный для липо-бокса спирохет (в соответствии с критерием D. haake [16]). Таким образом, в результате проведенного био-информатического анализа было установлено, что последовательности 5 белков (Tp0136, Tp0163, Tp0453, Tp0684, Tp0971) обладают структурой, характерной для липопротеинов спирохет. Анализ расположения белков в клетке. Определение клеточной локализации белков T. pallidum I ТАБЛИЦА 2 Результаты биоинформатического анализа белков T. pallidum Номер открытой рамки считывания Клеточная локализация Локализация на наружной мембране (наличие бета-складчатых участков) Количество альфаспиральных трансмем бранных участков Наличие сигнальной последова тельности Наличие сайта липидирования Клеточная локализация (на основании комплексного анализа) Специфичность для рода Treponema Программа PSORTb 3.0 Cello BOMP TMBETA- DISC- PSSM TMHMM SignalIP 3.0 UiB Lipo Lipo P TP1038 Цитопл. Цитопл. — — 0 — — — Цитопл. — TP0216 Цитопл. Цитопл. — — 0 — — — Цитопл. — TP0684 Перипл. Цитопл. — — 0 + — + Цитопл. мембр. — TP0769 Неизв. Цитопл./ наружн. мембр. — — 0 + — — Цитопл. мембр. — TP0971 Цитопл. Перипл./ цитопл. — — 0 + ++ + Цитопл. мембр. — TP0163 Цитопл. мебр. Цитопл. — — 0 + ++ + Цитопл. мембр. — Tp0108 Цитопл. Цитопл. — — 0 — — — Цитопл. — Tp0249 Перипл. Цитопл. — — 0 + — — Цитопл. мембр. — Tp0259 Цитопл. Цитопл. — — 0 — — — Цитопл. + Tp0608 Цитопл. Цитопл. — — 1 — — — Цитопл. + Tp0886 Цитопл. Цитопл. — — — — — Цитопл. — Tp0453 Неизв. Наружн. мембр. — + 1 + + + Наружн. мембр. + Tp0326 Наружн. мембр. Наружн. мембр. + + 1 + — — Наружн. мембр. — Tp0136 Секр. Секр. — — 1 + — + Цитопл. мебр. — Tp0965 Цитопл. Цитопл. — — 1 — — — Цитопл. мебр. — Примечание. Цитопл. — цитоплазматический; перипл. — периплазматический; неизв. — неизвестно; наружн. мембр. — наружная мембрана; секр.— секретируемый; цитопл. мембр. — цитоплазматическая мембрана. ■ Вестник дерматологии и венерологии Научные исследования А 61 на основании анализа их аминокислотной последовательности сопряжено с трудностями, вызванными особым строением молекулярного комплекса, обеспечивающего транспорт белков через мембрану. Например известно, что для большинства микроорганизмов расположение бактериальных липопротеинов хорошо согласуется с природой аминокислотного остатка во втором положении после сайта отщепления сигнального пептида: в случае присутствия в этом участке аспарагиновой кислоты соответствующий белок локализуется на внутренней цитоплазматической мембране, если же на этом участке находится любая другая аминокислота, то соответствующий белок расположен на наружной мембране [30]. Однако для T. pallidum присутствие аспарагиновой кислоты в зрелом белке после N-концевого метионина не коррелирует с расположением белка на цитоплазматической мембране [31]. Поэтому при определении клеточной локализации белков T. pallidum помимо специализированных серверов нами было проведено дополнительное исследование других структурных свойств белков — наличия сигнальных последовательностей, сайтов ли-пидирования и трансмембранных альфа-спиральных областей. при предсказании локализации антигена в клетке с помощью программ PSORTb и CELLO цитоплазматическая локализация была установлена обеими программами для 7 белков: Tp0108, Tp0216, Tp0259, Tp0608, Tp0886, Tp0965 Tp1038. Белок Tp0326 был определен как белок наружной мембраны, а белок Tp0136 определился обеими программами как секре-тируемый. Для белков Tp0453, Tp0684, Tp0769, Tp0971, Tp0163, Tp0249 субклеточные локализации, предсказанные программами pSORTb и CELLO, не совпадали или идентифицировались только одной из программ. поэтому для повышения точности анализа первичная структура отобранных белков была дополнительно изу- Тр0684 Tp0971 Tp0163 Tp0453 Tp0136 MKGTGMCVALLLCALGAGAC*KRSEK MKRVSLLGSAAIFAL|VFSA|*CGGGGEHQ MQRCSVVAALAGVVF|LAQA|*CSLSTPSRITHTDKLP MIRRRYRGCTQGA IVSVGMLFAS*CTSGAWKASVD MGRSTMDTQYMRRRVCTVVRAVVCLLSTSLLTT* CD Сайт расщепления N-регион результирующий положительный заряд >2 остатков аминокислот H-регион >6 остатков аминокислот не должен содержать K, R, D, E и H С-регион липо-бокс Позиция «-1» — может быть A, G, S, N или С Позиции «-3»/«-4» — должны содержать L, V или F Не должен содержать аминокислот K, R, D, E и H а б Рис. 2. Сравнение N-концевых последовательностей белков T. pallidum с консенсусной структурой липо-бокса спирохет: а — N-концевые последовательности белков T.pallidum, определенные программой LipoP как липопротеины; 6 — схема организации липо-бокса липопротеинов спирохет, согласно D. Haake [16] (полужирным шрифтом выделены аминокислотные остатки липо-бокса; звездочкой отмечен сайт расщепления сигнального пептида) 62 L № 5, 2012 чена путем определения сигнальных последовательностей, альфа-спиральных участков и бета-складчатых структур. Также при установлении расположения белка в клетке применялся поиск гомологичных белков других микроорганизмов с известной локализацией. Известно, что присутствие сигнального пептида является характерной особенностью предшественников мембранных белков; при этом сигнальные пептиды специфических классов секретируемых белков распознаются различными сигнальными пептидазами. Сигнальная последовательность липопротеинов обязательно содержит цистеин, к которому присоединяются жирные кислоты [31]. при проведении исследований с использованием сервера Signalp 4.0 присутствие сигнального пептида было установлено для 8 из 15 изучавшихся белков T. pallidum (Tp0136, Tp0163, Tp0249, Tp0326, Tp0453, Tp0684, Tp0769 и Tp0971), что указывало на вероятный экспорт этих белков через цитоплазматическую мембрану. Согласно данным литературы, вероятность локализации белков со значительным количеством предсказанных альфа-спиральных участков на наружной мембране невелика [32], поэтому определение в последовательности белка предсказанных множественных альфа-спиральных участков исключает его локализацию на наружной мембране и позволяет рассматривать его как белок цитоплазматической мембраны. проведенное с использованием программы THHMM исследование показало наличие единичных трансмембранных альфа-спиральных участков для 5 из 15 белков T. pallidum (Tp0136, Tp0326, Tp0453, Tp0608, Tp0965). Таким образом, для этих белков не исключалась вероятность локализации на наружной мембране микроорганизма, так как отсутствие в структуре белка нескольких альфа-спиральных участков указывает на возможность их транспорта через цитоплазматическую мембрану [33]. при осуществлении биоинформатического анализа последовательностей белков, для которых были показаны иммуногенные свойства и выявлена локализация на наружной мембране, мы определяли наличие бета-складчатых структур с помощью серверов BOMp, TMBETADiSC, так как считается, что бета-складчатые структуры являются универсальной характеристикой топологии бактериальных белков на наружной мембране [13]. Из 15 антигенов возбудителя сифилитической инфекции, отобранных для биоинформатического анализа, присутствие бета-складчатых структур было показано только для двух белков — Tp0326 и Tp0453; кроме того, для них же было установлено отсутствие множественных трансмембранных альфа-спиральных областей. это позволило выдвинуть рабочую гипотезу о локализации белков Tp0326 и Tp0453 именно на наружной (а не на цитоплазматической) мембране T. pallidum. Дополнительное изучение данных науч ной литературы позволило выявить экспериментальные доказательства расположения белков Tp0326 и Tp0453 на наружной мембране [13], что подтвердило эффективность использованных нами биоинформати-ческих подходов. Белок Tp0965 был определен программами pSORTb и CELLO как цитоплазматический, для белка Tp0249 анализ структуры программой CELLO выявил цитоплазматическую локализацию, программой pSORTb — периплазматическую. Однако комплексный анализ последовательности этих белков выявил структурные особенности, которые не позволяют отнести их к цитоплазматическим белкам. Для белка Tp0249 установлено наличие сигнальной последовательности, что позволяет рассматривать данный белок в качестве предшественника мембранных белков. Кроме того, аминокислотная последовательность белка Tp0249 проявляет большое сходство (свыше 70%) с белком филаментов FlaA родственных спирохет, для которых характерно периплазматическое расположение. Так как результаты анализа последовательности этих белков не выявили наличия бета-складчатых структур, эти белки не могут рассматриваться как белки наружной мембраны. Результаты поиска схожих белковых последовательностей белков по базам данных при помощи программы pSi-BLAST показали, что последовательность белка Tp0965 обладает высоким уровнем сходства с последовательностью связанных с цитоплазматической мембраной периплазматических субъединиц бактериальных транспортеров семейства RND грамотри-цательных микроорганизмов. Обнаруженное нами несоответствие результатов биоинформатического анализа клеточной локализации белков Tp0249 и Tp0965 может объясняться тем, что биоинформатические программы pSORTb и CELLO, разработанные для предсказания клеточной локализации белков, создавались на основе знаний о структуре белков наиболее изученного грамотри-цательного микроорганизма — E. coli и не учитывали особенностей системы трансмембранного переноса белков T. pallidum. Таким образом, комплексный анализ последовательностей белков Tp0249 и Tp0965 позволил определить их локализацию на цитоплазматической мембране, в периплазматическом пространстве клетки T. pallidum. Анализ наличия сигнальной последовательности и гомологии изучавшихся белков T. pallidum с известными мембранными белками показал, что характерными структурными особенностями белков цитоплазматической мембраны обладали 7 белков: Tp0136, Tp0163, Tp0249, Tp0769, Tp0684, Tp0965 и Tp0971. Для 4 из предсказанных белков цитоплазматической мембраны (Tp0136, Tp0163, Tp0684, Tp0971) также были обнаружены сайты липидирования, что позволяет предположить липопротеиновую природу этих антигенов. ■ Вестник дерматологии и венерологии Научные исследования л 63 Для белков, которые были определены как цитоплазматические (Tp0108, Tp0216, Tp0259, Tp0608, Tp0886 и Tp0965 Tp1038), сигнальные последовательности выявлены не были, что (вместе с отсутствием сайтов липидирования) служит подтверждением их цитоплазматической локализации. Таким образом, в результате комплексного анализа последовательностей 15 отобранных для изучения белков T. pallidum 2 белка (Tp0326 и Tp0453) были определены как белки наружной мембраны, для 7 белков (Tp0136, Tp0163, Tp0249, Tp0769, Tp0684, Tp0965 и Tp0971) была предсказана локализация на цитоплазматической мембране, для 6 белков (Tp0108, Tp0216, Tp0259, Tp0608, Tp0886 и Tp1038) была установлена цитоплазматическая локализация. Анализ специфичности выявленных белков T. pallidum для рода порядка Spirochaetales и рода Treponema. Анализ специфичности выявленных белков T. pallidum для порядка Spirochaetales и рода Treponema проводился с использованием базы данных Национальной лаборатории Лос-Аламоса (США) на основании анализа первичной структуры. Из всех 15 белков специфическими для порядка Spirochaetales оказались белки Tp0259, Tp0453, Tp0608, для ро да Treponema специфическими были только белки Tp0453 и Tp0608. Заключение применение современных методов биоинформатики позволило отобрать потенциальные диагностически значимые белковые антигены T. pallidum, которые в перспективе могут быть использованы при разработке новых тест-систем для диагностики сифилиса. учитывая такие показатели, как специфичность белков для порядка Spirochaetales и рода Treponema, кандидатами для изучения могут являться белки Tp0259, Tp0453, Tp0608. Однако при оценке специфичности антигенов в иммунологических исследованиях следует учитывать не только их первичную структуру, но и пространственное расположение антигенных эпитопов, что возможно проверить при экспериментальном изучении этих белков. поэтому для дальнейшего экспериментального изучения белковых антигенов T. pallidum с учетом их предсказанной клеточной локализации и наличия сайтов липидирования представляют интерес также белок наружной мембраны Tp0326, белок цитоплазматической мембраны Tp0249, липо-протеины Tp0136 и Tp0684.

References

  1. Черешнев В.А., Патрушева Н.Б., Бейкин Я.Б. и др. Сифилис: Иммунитет и лабораторная диагностика. Екатеринбург: УрО РАН; 200б.
  2. Соколовский Е., Фриго Н., Ротанов С. Руководство по лабораторной диагностике сифилиса в странах Восточной Европы. Вестн. дерматол. и венерол., 2008; (5): 87—96.
  3. Овчинников Н.М., Беднова В.Н., Делекторский В.В. Лабораторная диагностика заболеваний, передающихся половым путем. М.: Медицина, 1987.
  4. Китаева Н.В., Фриго Н.В., Мелехина Л.Е. Актуальные проблемы сифилидологии. Современные технологии диагностики сифилитической инфекции. Вестн. дерматол. и венерол., 2008; 5: 51—59.
  5. Китаева Н., Фриго Н., Ротанов С. и др. Перспективы диагностического использования протеомных технологий в диагностике ИППП и заболеваний кожи. Вестн. дерматол. и венерол., 2010; 4: 17—27.
  6. Sambri V., Marangoni A., Simone M. et al. Evaluation of recomWell Treponema, a novel recombinant antigen-based enzyme-linked immunosorbent assay for the diagnosis of syphilis. Clini microbiol and infect; 2001; 7 (4); 200—205.
  7. Sato N., Suzuki T., Ueda T. et al. Recombinant antigen-based immuno-slot blot method for serodiagnosis of syphilis. Braz Jf medi biol res; 2004; 37: (7): 949—955.
  8. Приказ Минздрава РФ № 87 от 26.03.2001 «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса».
  9. Young H. SYPHILIS: Serology. Dermatol clini; 1998; 16 (4); 691—698.
  10. Riviere G.R., Wagoner M.A., Baker-Zander S.A. et al. Identification of spirochetes related to Treponema pallidum in necrotizing ulcerative gingivitis and chronic periodontitis. N Engl J Med 1991; 325 (8); 539—543.
  11. Carlson J.A., Dabiri G., Cribier B. et al. The immunopathobiology of syphilis: the manifestations and course of syphilis are determined by the level of delayed-type hypersensitivity. Amer Jf dermatopathol; 2011; 33 (5): 433—460.
  12. Tomson F.L., Conley P.G., Norgard M.V. et al. Assessment of cell-surface exposure and vaccinogenic potentials of Treponema pallidum candidate outer membrane proteins. Microbes and infection; 2007; 9 (11); 1267—1275.
  13. Cox D.L., Luthra A., Dunham-Ems S. et al. Surface immunolabeling and consensus computational framework to identify candidate rare outer membrane proteins of Treponema pallidum. Infect and Immun; 2010; 78 (12): 5178—5194.
  14. Brinkman M.B., Mckevitt M., Mcloughlin M. et al. Reactivity of antibodies from syphilis patients to a protein array representing the Treponema pallidum proteome. J clini microbiol; 2006; 44 (3); 888—891.
  15. Mcgill M.A., Edmondson D.G., Carroll J.A. et al. Characterization and Serologic Analysis of the Treponema pallidum Proteome. Infect and Im-muni; 2010; 78 (6); 2631—2643.
  16. Haake D.A. Spirochaetal lipoproteins and pathogenesis. Microbiol; 2000; 146 (7); 1491—1504.
  17. Norris S.J., Cox D.L., Weinstock G.M. Biology of Treponema pallidum: correlation of functional activities with genome sequence data. J Mol Microbiol Biotechnol 2001; 3 (1); 37—62.
  18. Mckevitt M., Brinkman M.B., Mcloughlin M. et al. Genome scale identification of Treponema pallidum antigens. Infect and Immuni 2005;73 (7); 4445—4450.
  19. Entrez: the Life Sciences Search Engine [Internet]. Bethesda (MD): National Library of Medicine (US), National Center for Biotechnology Information. 1991; Доступно по адресу: http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/protein
  20. Altschul S.F., Gish W., Miller W. et al. Basic local alignment search tool. J f Molec Biol 1990; 215 (3); 403—410.
  21. Berven F.S., Karlsen O.A., Straume A.H. et al. Analysing the outer membrane subproteome of Methylococcus capsulatus (Bath) using pro-teomics and novel biocomputing tools. Arch Microbiol 2006; 184 (6); 362—377.
  22. Juncker A.S., Willenbrock H., Von Heijne G. et al. Prediction of lipoprotein signal peptides in Gram — negative bacteria. Protein Science 2009;12 (8); 1652—1662.
  23. Yu N.Y., Wagner J.R., Laird M.R. et al. PSORTb 3.0: improved protein subcellular localization prediction with refined localization subcategories and predictive capabilities for all prokaryotes. Bioinformatics 2010; 26 (13): 1608—1615.
  24. Yu C.S., Chen Y.C., Lu C.H. et al. Prediction of protein subcellular localization. Proteins: Structure, Function and Bioinformatics 2006; 64 (3) 643—651.
  25. Moller S., Croning M.D., Apweiler R. Evaluation of methods for the prediction of membrane spanning regions. Bioinformatics 2001; 17 (7): 646—653.
  26. Petersen T.N., Brunak S., Von Heijne G. et al. SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions. Nat Methods. 2011 Sep 29; 8 (10):785-6. doi: 10.1038/nmeth.1701.;
  27. Berven F.S., Flikka K., Jensen H.B. et al. BOMP: a program to predict integral β-barrel outer membrane proteins encoded within genomes of Gram-negative bacteria. Nucleic acids research 2004;32 (suppl 2); W394-W399.
  28. Ou Y.Y., Gromiha M.M., Chen S.A. et al. TM-BETADISC-RBF: Discrimination of-barrel membrane proteins using RBF networks and PSSM profiles. Computational biology and chemistry; 2008; 32 (3); 227.
  29. STD Sequence Databases — 2003; Доступно по адресу: http://www.stdgen.lanl.gov
  30. Yamaguchi K., Yu F., Inouye M. A single amino acid determinant of the membrane localization of lipoproteins in E. coli. Cell 1988; 53 (3): 423—432.
  31. Setubal J.C., Reis M., Matsunaga J. et al. Lipoprotein computational prediction in spirochaetal genomes. Microbiol 2006; 152 (1): 113—121.
  32. Cullen P.A., Haake D.A., Adler B. Outer membrane proteins of pathogenic spirochetes. FEMS Microbiol Revi; 2004; 28 (3): 291—318.
  33. Rey S., Acab M., Gardy J.L. et al. PSORTdb: a protein subcellular localization database for bacteria. Nuclc acids Rese 2005; 33 (suppl 1); D164-D168.

Statistics

Views

Abstract - 629

PDF (Russian) - 366

PlumX

Article Metrics

Metrics Loading ...

Dimensions

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2012 KHAIRULLIN R.F., ROTANOV S.V., FRIGO N.V., BELOUSOVA A.V.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies