Comparative study of anti-inflammatory activity of zinc pyrition on a psoriasis laboratory model

Full Text

Псориаз — хроническое мультифакториальное иммуноопосредованное заболевание кожи. Ключевым звеном патогенеза считается дисбаланс про- и противовоспалительных цитокинов, приводящий к развитию хронического воспалительного процесса в эпидермисе и дерме.

Наружная терапия имеет большое значение для больных псориазом. При легкой степени тяжести ее получают больные в качестве монотерапии, а при среднетяжелом и тяжелом течении — как дополнительное лечение [1].

Современные алгоритмы наружной терапии псориаза предполагают использование топических глюкокортикостероидных (ГКС) и других противовоспалительных препаратов. Эффективность и безопасность ГКС хорошо известны, однако возникающие при длительном применении такие нежелательные явления, как развитие вторичной инфекции, атрофии кожи, телеангиэктазии, акнеформной сыпи, гипертрихоза, ограничивают длительность их применения. Кроме того, назначение ГКС препаратов при высыпаниях в области лица, половых органов и крупных складках кожи значительно повышает вероятность появления нежелательных явлений [2].

Приверженность местной терапии является ключевой проблемой при псориазе. Зачастую именно стероидофобия может приводить к снижению комплаентности и отсутствию эффекта от лечения, что сопровождается неудовлетворенностью терапией и низким качеством жизни пациента [3].

В связи с этим нестероидные противовоспалительные средства на основе цинка пиритиона могут быть альтернативой топическим ГКС препаратам в терапии псориаза [4].

Пиритион цинка обладает антибактериальными, противовоспалительными и антипролиферативными свойствами, в то же время на нормально делящиеся клетки не оказывает негативного действия. Установлена также способность цинка ингибировать выделение гистамина тучными клетками и уменьшать зуд кожи [5].

Для оценки эффективности топических препаратов на основе пиритиона цинка, сравнения их силы действия с ГКС и возможности развития нежелательных явлений весомый вклад могут внести экспериментальные работы на лабораторных животных. Они позволяют достаточно быстро моделировать проявления заболевания, и в то же время менее строги в этических аспектах [6].

Особый интерес вызывает имиквимод-индуцированная модель, на которую приходится значительная доля исследований псориаза во всем мире. Это объясняется как доступностью условий для формирования модели, так и ее патогенетическим и морфологическим сходством с дерматозом.

Оценка противовоспалительной активности цинка пиритиона активированного и исследование наличия у него атрофогенного действия представляют научный и практический интерес.

Цель исследования. На лабораторной модели псориаза провести сравнительную оценку противовоспалительной эффективности скин-капа в сравнении с другими препаратами.

Материалы и методы исследования

В эксперименте использовали инбредных мышей Balb/c в количестве 50 особей. Формирование псориазиформного воспаления кожи проводили путем ежедневного нанесения препарата имиквимод 1 раз в день в течение 14 дней — острая модель воспаления «Имиквимод индуцированный псориаз у мышей».

После индукции модели мышей рандомизировали на 5 групп по 10 особей (рис. 1). Мышам I группы на 15-й день провели эвтаназию с биопсией кожи. Мышам II группы наносили крем с цинком пиритионом активированным (скин-кап), III группы — крем с пиритионом цинка (цинокап), IV группы — крем с бетаметазоном дипропионатом (акридерм) по 2 раза в день — 14 дней. Контрольная группа мышей (V) находилась под наблюдением без терапии.

Ежедневно проводили клиническую оценку тяжести воспаления кожи с помощью PASI-модифицированного индекса (mPASI). Определяли показатели: эритема, индурация, шелушение по пятибалльной шкале от 0 до 4.

На 29-й день исследования мышам II—V групп проводили эвтаназию. С полученными биоптатами кожи выполняли гистологическое (толщина эпидермиса, выраженность акантоза, гиперкератоза и воспалительного инфильтрата) и иммуногистохимическое исследование (пролиферативная активность клеток эпидермиса — маркер Ki-67, содержание лимфоцитов — маркер CD3). Выраженность гистологических изменений оценивали по четырехбалльной шкале («-» — отсутствие признака, «+» — слабо выраженный, «++» — средней выраженности, «+++» — выраженный признак). Для определения количества окрашенных клеток при иммуногистохимическом исследовании анализировали 3 поля зрения при увеличении ×200, выбранные с учетом наибольшего количества меченых клеток.

Статистическая обработка данных проводилась с использованием программы «STATISTICA 10.0» (StatSoft, Inc). Для сравнения данных между группами применяли U-критерий Манна — Уитни. Достоверным считали различия при p<0,05.

Результаты исследования

После индукции модели воспаления имиквимодом на коже мышей на 14-й день отмечалось формирование псориазиформных элементов. На 28-й день исследования в V группе клинические изменения были выражены значительно, во II, III — слабо (рис. 2) (табл. 1). В группе II, получающей цинка пиритион активированный, индекс mPASI был ниже, чем в группе III пиритиона цинк. При использовании глюкокортикостероидного препарата наблюдались наименьшие значения индекса mPASI, но статистически значимых различий в группах II (цинк пиритион активированный) и IV (бетаметазона дипропионат) не выявлено (p>0,05).

При оценке гистологических изменений в I группе (имиквимод) наблюдались характерные для псориаза признаки: в эпидермисе акантоз и паракератоз, в верхних слоях дермы — лимфогистиоцитарный инфильтрат и расширение сосудов (рис. 2). В V группе выявлено частичное уменьшение этих проявлений. При применении бетаметазона дипропионата и цинка пиритиона активированного обнаружено наиболее значимое уменьшение толщины эпидермиса и выраженности лимфогистиоцитарного инфильтрата (табл. 2). В то же время при применении глюкокортикостероидного крема наблюдались начальные проявления стероидной атрофии кожи (гипотрофия клеток эпидермиса и дермы, сглаживание эпидермальных отростков), что не отмечалось в группе, получающей цинк пиритион активированный.

 

Рис. 1. Дизайн исследования

 

При иммуногистохимическом анализе проводили оценку площади экспрессии CD3+-клеток (маркер Т-лимфоцитов) и Ki67+-клеток (маркер пролиферации) (табл. 3). Установлено, что в группе I (имиквимод) наблюдалось наиболее выраженное количество CD3+-клеток.

На фоне проводимой терапии отмечалось уменьшение количества CD3+-клеток в коже: наименьшее количество обнаружено в группе IV (бетаметазона дипропионат), далее — в нарастающем порядке: в группе II (цинк пиритион активированный) и группе III (пиритион цинка) (рис. 3). Выявлено, что уровень пролиферативной активности клеток кожи в группах, где применяли препараты (II, III, IV), значительно ниже, чем в группах без терапии (I, V) (рис. 4). При сравнении групп, получающих лечение, не обнаружено статистически значимых различий, но отмечено, что наиболее выраженное снижение пролиферативной активности наблюдалось в группе IV (бетаметазона дипропионат), затем — в группе II (цинк пиритион активированный) и наименьшее — в группе III (пиритион цинка) и V (наблюдение).

Обсуждение

На лабораторной модели псориаза нам удалось провести клиническую и патоморфологическую оценку противовоспалительного эффекта препарата скин-кап и сравнить его с другими топическими лекарственными средствами.

Экспериментальная модель заболевания позволяет проводить клиническое, гистологическое и иммуногистохимическое исследование динамики изменений, происходящих в эпидермисе и дерме в процессе терапии наружными препаратами [6].

В ходе исследования выявлено, что применение препарата цинка пиритион активированного приводит к выраженному разрешению высыпаний, проявляющемуся в уменьшении эритемы, шелушения и индурации кожи. Противовоспалительный эффект скин-капа был сопоставим с галогенизированным глюкокортикостероидом, лишь незначительно уступая ему. Другой аналог — пиритиона цинк (цинокап) уступал по противовоспалительной активности.

Гистологическое исследование кожи в изучаемых группах показало, что все препараты вызывают уменьшение толщины кожи за счет значительного разрешения акантоза в эпидермисе. Отмечено, что в группе, получающей скин-кап, на 29-й день исследования гиперкератоз и лимфогистиоцитарный инфильтрат практически не наблюдались, как и в группе, получающей бетаметазона дипропионат. В то же время выявленные при лечении бетаметазона дипропионатом проявления стероидной атрофии кожи (истончение эпидермиса за счет уменьшения размеров кератиноцитов, сглаживание эпидермальных отростков) отсутствовали в группе пациентов, применяющих скин-кап.

Изучение результатов иммуногистохимического анализа кожи показало, что применение противовоспалительных препаратов приводит к нормализации скорости деления клеток эпидермиса. Наиболее выраженный эффект установлен при использовании бетаметазона дипропионата, почти такой же у скин-капа, менее выраженный — у пиритиона цинка (цинокап). Исследование уровня экспрессии маркера CD3-лимфоцитов выявило сходную тенденцию, при использовании скин-капа наблюдалось четырехкратное снижение содержания Т-лимфоцитов в коже.

 

Рис. 2. Данные клинического (А) и гистологического (Б) исследования кожи в группе I – имиквимода (2.1), V – наблюдения (2.2), III – цинокапа (2.3), II – скин-капа (2.4), IV – акридерма (2.5)

 

Таблица 1. Клиническая оценка тяжести изменения кожи в исследуемых группах

Table 1. Clinical assessment of the severity of skin changes in the study groups

№	Препарат	Эритема	Индурация	Шелушение	mPASI
1	Имиквимод (И)	2,1 [1, 5-2, 6]	3,1 [2, 1-3, 6]	2 [1, 2-2, 3]	7,2 [5, 2-9, 3]
2	И+цинка пиритион активированный (скин-кап)	0,8 [0, 5-1, 2]	0,5 [0, 3-0, 9]	0,5 [0, 2-0, 8]	1,8 [1, 1-3, 2]
3	И+пиритион цинка (цинокап)	1,1 [0, 9-1, 7]	1,1 [0, 8-1, 6]	0,7 [0, 4-0, 9]	2,9 [2, 1-4, 2]
4	И+бетаметазона дипропионат (акридерм)	0,5 [0, 3-0, 8]	0,8 [1, 0-1, 9]	0 [0-0, 2]	1,3 [1, 0-3, 1]
5	И+наблюдение	1,9 [1, 4-2, 5]	2,7 [2, 1-3, 5]	1,2 [0, 9-1, 8]	5,8 [5, 0-6, 8]

 

Таблица 2. Гистологические изменения кожи исследуемых групп

Table 2. Histological changes in the skin of the studied groups

№	Препарат	Толщина эпидермиса, мкм	Акантоз	Гиперкератоз	Лимфогистиоцитарный инфильтрат
1	Имиквимод (И)	2,1 [1, 5-2, 6]	3,1 [2, 1-3, 6]	2 [1, 2-2, 3]	7,2 [5, 2-9, 3]
2	И+цинка пиритион активированный (скин-кап)	0,8 [0, 5-1, 2]	0,5 [0, 3-0, 9]	0,5 [0, 2-0, 8]	1,8 [1, 1-3, 2]
3	И+пиритион цинка (цинокап)	1,1 [0, 9-1, 7]	1,1 [0, 8-1, 6]	0,7 [0, 4-0, 9]	2,9 [2, 1-4, 2]
4	И+бетаметазона дипропионат (акридерм)	0,5 [0, 3-0, 8]	0,8 [1, 0-1, 9]	0 [0-0, 2]	1,3 [1, 0-3, 1]
5	И+наблюдение	1,9 [1, 4-2, 5]	2,7 [2, 1-3, 5]	1,2 [0, 9-1, 8]	5,8 [5, 0-6, 8]

 

Таблица 3. Уровень экспрессии иммуногистохимических маркеров

Table 3. Expression level of immunohistochemical markers

№	Группа	CD3+-клетки	Ki67+-клетки
1	Имиквимод (И)	45 [39-52]	92 [82-103]
2	И+цинка пиритион активированный	11 [8-16]	28 [22-34]
3	И+пиритион цинка	16 [12-19]	33 [27-39]
4	И+бетаметазона дипропионат	8 [2-13]	22 [16-29]
5	И+наблюдение	35 [30-43]	63 [56-69]

 

Рис. 3. Непрямое иммуногистохимическое исследование CD3+-клеток в коже на лабораторной модели псориаза до терапии (а), после терапии препаратом скин-кап (б)

 

Рис. 4. Непрямое иммуногистохимическое исследование Ki-67+-клеток в коже на лабораторной модели псориаза до терапии (а), после терапии препаратом скин-кап (б)

 

Применение препарата цинка пиритион активированного при имиквимод-индуцированном псориазиформном воспалении сопровождается значительным уменьшением количества клеток-эффекторов воспаления, что приводит к снижению уровня воспаления и проявляется клиническим улучшением. При этом гибель клеток происходит по апоптотическому пути, что доказано как in vitro, так и in vivo, и не сопровождается дополнительным выбросом медиаторов воспаления из погибших клеток. Свойство пиритиона цинка активировать апоптоз определяется наличием в нем ионов цинка. Активации апоптоза кератиноцитов пиритионом цинка предшествует выраженное противовоспалительное действие препарата, которое проявляется угнетением синтеза провоспалительных цитокинов лимфоцитами и кератиноцитами [5].

Выводы

В ходе проведенного экспериментального исследования на имиквимод-индуцированной лабораторной модели воспаления установлено, что применение препарата скин-кап приводит к подавлению воспалительного процесса в коже, сравнимое по эффективности с сильным топическим глюкокортикостероидом и превосходящее по силе действия его аналог.

Отсутствие атрофогенного эффекта на лабораторной модели псориаза позволяет предполагать сходные результаты при лечении человека.

About the authors

Alexander S. Zhukov

Federal state budgetary educational institution of higher military education “Military Medical Academy named after S.M. Kirov” of the Russian Ministry of Defense

Author for correspondence.
Email: doctor-vma@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4915-9157

Cand. Sci. (Med.); Doctoral Student of the Department of Skin and Veneral Diseases

Россия, Moscow

Vladislav R. Khairutdinov

Federal state budgetary educational institution of higher military education “Military Medical Academy named after S.M. Kirov” of the Russian Ministry of Defense

Email: haric03@list.ru

Dr. Sci. (Med.); Assoc. Prof.; Assoc. Prof. of the Department of Skin and Veneral Diseases

Россия, Saint-Petersburg

Aleksey V. Samtsov

Federal state budgetary educational institution of higher military education “Military Medical Academy named after S.M. Kirov” of the Russian Ministry of Defense

Email: avsamtsov@mail.ru

Dr. Sci. (Med.); Prof.; Head of the Department of Skin and Veneral Diseases

Россия, Saint Petersburg

References

Supplementary files