The new external drug for the treatment of psoriasis based on inhibition of serine proteases

Full Text

Псориаз – хроническое мультифакториальное иммуноопосредованное воспалительное заболевание, характеризующееся повышенной скоростью деления кератиноцитов.

Одним из ключевых цитокинов в патогенезе псориаза является IL-36. Генетические вариации рецептора этого цитокина ассоциированы с развитием пустулезных форм заболевания, но в последние годы появились исследования о роли IL-36 в патогенезе и бляшечного псориаза [1, 2].

По данным зарубежных авторов и наших исследований установлено, что в коже больных псориазом цитокины семейства IL-36 (α, β, γ) экспрессируются в повышенном количестве [3, 4]. Обнаружена ассоциация уровня IL-36γ со степенью тяжести заболевания, а также значение данного маркера для дифференциальной диагностики с другими хроническими дерматозами [3].

На лабораторной модели псориаза выявлена ключевая роль IL-36 в развитии воспалительной реакции. Установлено, что у генетически модифицированных мышей с повышенным синтезом IL-36α формируется псориатический фенотип: утолщение кожи, появление эритемы и шелушения. В то же время при инактивации рецептора IL-36 (IL-36R) высыпания разрешаются [4].

Примечательно, что IL-36 в коже находится в неактивной форме. Для его активации необходим протеолитический процессинг, который возможен при участии нейтрофильных сериновых протеаз (нейтрофильная эластаза, катепсин G, протеиназа-3), содержащихся в нейтрофильных гранулоцитах (рис. 1).

 

Рис. 1. Схема формирования IL-36-опосредованного воспаления у больных псориазом. NET — нейтрофильные внеклеточные ловушки, TLR — толл-подобные рецепторы, pDC — плазмацитоидные дендритные клетки, cDC — миелоидные дендритные клетки, Th17, Th22, Th1 — Т-клетки 17-, 22-, 1-го типа; IL-1, -17A, -22, -36 — интерлейкины 1, 17А, 22, 36 / Fig. 1. Scheme of the formation of IL-36-mediated inflammation in patients with psoriasis. NET — neutrophilic extracellular traps, TLR — toll-like receptors, pDC — plasmacytoid dendritic cells, cDC — myeloid dendritic cells, Th17, Th22, Th1 — T cells 17-, 22-, 1 type; IL-1, -17A, -22, -36 — interleukins 1, 17A, 22, 36

 

Микроабсцессы Мунро, состоящие из нейтрофилов, являются одним из ключевых гистологических признаков псориаза. Попадая в эпидермис из крови, нейтрофилы выбрасывают сетеподобные структуры, в состав которых входят и сериновые протеазы. Последние взаимодействуют с IL-36, повышая его активность до 500 раз, а также вызывают деградацию ряда структурных белков внеклеточного матрикса: эластина, протеогликана, коллагена и фибронектина [5]. Перечисленные факторы могут способствовать формированию аутоиммунного ответа при псориазе.

Повышенная концентрация сериновых протеаз нейтрофилов в верхних слоях эпидермиса позволяет предположить возможность использования топических таргетных препаратов, ингибирующих их активность. Такое избирательное действие в наружной форме препарата снизит частоту развития нежелательных явлений.

В нашем исследовании была поставлена задача создания топического лекарственного препарата, подавляющего активность IL-36-опосредованного псориатического воспаления в коже путем ингибирования сериновых протеаз. В качестве действующего вещества выбран селективный ингибитор сериновых протеаз – сивелестат. В настоящее время данный препарат в некоторых странах применяется для системной терапии легочного дистресс синдрома, где в патогенезе ведущую роль играет повышенный уровень протеаз нейтрофилов [6].

Цель исследования: изучение клинической эффективности препарата сивелестат на лабораторной модели имиквимод-индуцированного псориаза.

Методы

Дизайн исследования

В эксперименте использовали инбредных мышей линии BALB/c в количестве 40 особей, которых рандомизировали на 4 группы по 10 штук. Формирование псориазиформного воспаления кожи проводили путем ежедневного нанесения на выбритую кожу спины препарата имиквимод (Альдара) 1 раз в день – 10 дней – индукционная модель воспаления «Имиквимод индуцированный псориаз у мышей» [патент №2736000 С1 от 03.04.2020] (рис. 2).

 

Рис. 2. Дизайн исследования / Fig. 2. Study design

 

Мышам группы №I терапия не проводилась (контроль). Начиная с 6 дня формирования модели через 1 час после нанесения имиквимода, мышам группы №II наносили мазь (вазелин), содержащую 1% сивелестат 1 р/д – 5 дней, группы №III – крем (ланолин + масло оливковое + вода в равных долях), содержащий 1% сивелестат 1р/д – 5 дней, группы №IV – крем бетаметазона дипропионат 1% (Акридерм) 1 р/д – 5 дней. Ежедневно проводили клиническую оценку высыпаний на коже по PASI-модифицированному методу (mPASI). Определяли показатели: эритема, индурация, шелушение по 5-ти бальной шкале от 0 до 4. На 11 день исследования всем мышам проводили эвтаназию с биопсией кожи. С полученными биоптатами кожи выполняли гистологическое (оценка толщины эпидермиса, выраженности акантоза, гиперкератоза и воспалительного инфильтрата) и иммуногистохимическое (определение пролиферативной активности клеток эпидермиса – маркер Ki-67, содержания лимфоцитов – маркер CD3) исследование. Выраженность акантоза, гиперкератоза и воспалительного инфильтрата оценивали по 4-х бальной шкале («-» – отсутствие признака, «+» – слабо выраженный, «++» – средней выраженности, «+++» – выраженный признак). Подсчет количества меченых клеток проводили при увеличении ×200 на поле, площадью 0,34 мм2.

Критерии соответствия

Все исследования проводились на лабораторных животных: инбредных мышах линии BALB/c, поставляемых питомником (ФГУП «Питомник лабораторных животных «Рапполово»; Рапполово, Ленинградская область). Распределение животных на группы после окончания карантинного периода выполнялось с помощью метода рандомизации

Условия проведения

Экспериментальное исследование выполнено в виварие ФГБВОУ ВО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ в соответствии с Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ и общепринятыми методикам и правилам, принятым Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для исследовательских и иных научных целей (European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and other Scientifi c Purposes (ETS 123). Strasbourg, 1986).

Продолжительность исследования

Запланированное время проведения экспериментального исследования – 10 дней

Описание медицинского вмешательства

Исходы исследования

Основной исход исследования:

В качестве основного исхода принимали разрешение высыпаний на коже в исследуемой группе достоверно более значимое, чем в группе плацебо по индексу mPASI

Дополнительные исходы исследования: в качестве дополнительных исходов принимали снижение толщины эпидермиса, уровня экспрессии маркеров CD3+ и Ki-67+ достоверно более значимое чем в группе плацебо

Анализ в подгруппах

не проводился

Методы регистрации исходов

Для регистрации исходов использовали PASI-модифицированный метод оценки высыпаний на коже (mPASI), гистологический и иммуногистохимический метод исследования кожи.

Этическая экспертиза

На работу получено заключения этического комитета на проведение исследования №245 от 24.11.2020 г. НЭК Военно-медицинской академии им.С.М. Кирова.

Статистический анализ

Принципы расчета размера выборки:

Количество лабораторных животных определялось рассчитанным числом, необходимым для проверки статистической гипотезы.

Методы статистического анализа данных:

Статистическая обработка данных проводилась с использованием программы «STATISTICA 10.0» (StatSoft, Inc). Для сравнения данных между группами применяли U-критерий Манна-Уитни. Данные представлены в виде M [IQR], где M – медиана, IQR – межквартильный интервал. Достоверным считали различия при p<0,05.

Результаты

Объекты (участники) исследования

Все используемые лабораторные животные относились к одной линии инбредных мышей BALB/c, имели одинаковый пол (самки), сходны возраст (40±15 сут) и вес (18–20 г.).

Основные результаты исследования

В ходе индукции модели псориаза на 5 день у лабораторных животных сформировался псориазиформный фенотип: эритема, шелушение, утолщение кожи. На 10 день исследования в группе №1 (без терапии) клинические изменения были ярко выражены (рис. 3).

 

Рис. 3. Результаты клинической оценки высыпаний (3.1–3.4); гистологическое исследование кожи (3.5–3.8); иммуногистохимическое исследование CD3+-клеток (3.9–3.12); Ki-67+-клеток (3.13–3.16) в исследуемых группах Примечание. При гистологическом исследовании кожи окраска: гемэозин. Увеличение ×100; иммуногистохимическое исследование. Увеличение ×100. / Fig. 3. Results of clinical assessment of rashes (3.1–3.4); histological examination of the skin (3.5–3.8); immunohistochemical study of CD3 + cells (3.9–3.12); Ki-67 + cells (3.13–3.16) in the study groups
Note. On histological examination of the skin, the color: hemeeosin. Magnification ×100; immunohistochemical study. Magnification ×100.

 

При сравнении результатов оценки mPASI установлено, что значение данного показателя в группах животных, получающих сивелестат крем/мазь и Акридерм достоверно ниже, чем в группе без лечения (p<0,05). Наименьшие значения наблюдались в группе, получающей глюкокортикостероидный препарат  (снижение mPASI на 83%) и в группе, где использовали сивелестат крем (снижение mPASI на 50%) (табл.1).

При оценке гистологических изменений в группе №1 (без терапии) выявлены характерные для псориаза признаки: в эпидермисе – выраженный акантоз и паракератоз, в дерме – лимфогистиоцитарный инфильтрат и расширенные сосуды (рис. 3). В группе №4 (Акридерм) патоморфологические изменения практически отсутствовали. В группе №2 (сивелестат мазь) и №3 (сивелестат крем) отмечались не выраженные гистопатологические изменения кожи: умеренный акантоз, фокальный гиперкератоз и скудный лимфогистиоцитарный инфильтрат вокруг слабо расширенных сосудов сосочковой дермы (табл. 2).

Установлено, что толщина эпидермиса группы животных №1 (без терапии) была в 2,4-3,6 раза больше, чем в группах, где применяли терапию (p<0,05). При попарном сравнении групп, получающих различную терапию, значимых различий толщины эпидермиса не выявлено.

При иммуногистохимическом исследовании кожи установлено высокое содержание CD3+-клеток в группе контроля. После лечения препаратом сивелестат количество CD3+-клеток в коже было меньше в 1,8-2,2 раза, чем в группе без терапии (p<0,05).

Оценка уровня пролиферативной активности (Ki-67+-клетки) кожи показала, что в группах, где применяли препарат сивелестат, данный показатель ниже в 2,3-2,9 раза, чем в группе без терапии (p<0,05).

В группе бетаметазона дипропионата наблюдались наименьшие значения уровней экспрессии маркеров CD3 и Ki67 по сравнению с группой контроля и группами сивелестатом крем/мазь (p<0,05 при попарных сравнениях).

Дополнительные результаты исследования

Нежелательные явления

За время проведения исследования не обнаружено токсического действия или непереносимости препарата.

 

Таблица 1. Клиническая оценка тяжести изменения кожи животных в исследуемых группах на 10-й день эксперимента / Table 1. Clinical assessment of the severity of changes in the skin of animals in the study groups on the 10th day of the experiment

№	Группа	Эритема	Индурация	Шелушение	mPASI
1	Контроль	2,5 [1, 9-2, 8]	2,9 [2, 1-3, 2]	2,7 [2, 2-3, 1]	8,1 [7, 4-8, 7]
2	Сивелестат мазь	2,1 [0, 5-1, 3]	2,4 [0, 6-1, 2]	0,7 [0, 7-1, 2]	5,2 [2, 2-3, 2]*
3	Сивелестат крем	1,5 [0, 9-1, 9]	1,6 [1, 0-2, 1]	0,9 [0, 4-1, 2]	4,0 [0, 7-1, 4]*
4	Акридерм	0,4 [0, 1-0, 7]	0,7 [0, 2-1, 0]	0,1 [0, 0-0, 2]	1,3 [1, 0-1, 8]*

 

Примечание: данные представлены в виде M [IQR], где M – медиана, IQR – межквартильный интервал, * - p<0,05 при сравнении с группой контроля

 

Таблица 2. Гистологические изменения кожи животных в исследуемых группах на 10-й день эксперимента / Table 2. Histological changes in the skin of animals in the study groups on the 10th day of the experiment

№	Группа	Толщина эпидермиса, мкм	Акантоз	Гиперкератоз	Лимфогистиоцитарный инфильтрат
1	Контроль	97 [84-98]	+++	+++	+++
2	Сивелестат мазь	40 [37-47]*	++	++	+
3	Сивелестат крем	32 [31-44]*	+	+	+
4	Акридерм	27 [23-29]*	-	+	-

 

Примечание: данные представлены в виде M [IQR], где M – медиана, IQR – межквартильный интервал, * - p<0,05 при сравнении с группой контроля

 

Таблица 3. Уровень экспрессии иммуногистохимических маркеров кожи животных в исследуемых группах на 10-й день эксперимента / Table 3. Expression level of immunohistochemical markers of animal skin in the study groups on the 10th day of the experiment

№	Группа	CD3+-клетки	Ki67+-клетки
1	Контроль	101 [79-135]	316 [292-334]
2	Сивелестат мазь	54 [48-55]*	109 [105-115]*
3	Сивелестат крем	45 [43-52]*	140 [81-143]*
4	Акридерм	7 [6-11]*	52 [50-56]*

 

Примечание: данные представлены в виде M [IQR], где M – медиана, IQR – межквартильный интервал, * - p<0,05 при сравнении с группой контроля

 

Обсуждение

Резюме основного результата исследования

Результаты проведенного исследования продемонстрировали антипролиферативное, противовоспалительное и разрешающее действие препарата сивелестат, что позволяет рекомендовать его дальнейшее изучение для лечения больных псориазом.

Обсуждение основного результата исследования

Арсенал дерматовенеролога при выборе наружных средств включает несколько групп препаратов: глюкокортикостероидные, содержащие синтетический аналог витамина Д, салициловую кислоту, деготь и некоторые другие. Основным их недостатком является неспецифичность действия на ключевые звенья развития воспалительного процесса при псориазе, что может проявляться как появлением нежелательных явлений, так и недостаточной активностью.

Препараты, ингибирующие TNFα, IL-17A и IL-23, показали наибольшую клиническую эффективность в лечении больных псориазом, но системное иммуносупрессивное влияние, необходимость регулярного введения и высокая стоимость ограничивают их использование.

Принципиальным отличием в реализации эффектов IL-36 от других провоспалительных цитокинов является его активация в коже непосредственно в очаге воспаления при участии сериновых протеаз (рис. 1). Кроме того, продукция IL-36 при травматизации позволяет объяснить формирование феномена Кебнера и характерную локализацию высыпаний. При повреждении кожи происходит активация Toll-подобных рецепторов 3 типа (TLR3) на кератиноцитах, что приводит к выбросу IL-36 [7]. Активированный IL-36 с одной стороны индуцирует синтез IL-23 дендритными клетками, запуская IL-17-опосредованное воспаление, с другой – инициирует синтез в кератиноцитах антимикробных регенеративных белков (REG3A) и сосудистого эндотелиального фактора роста А (VEGF-A). Активации этих факторов способствует пролиферации кератиноцитов, гиперплазии эпидермиса и разрастанию клеток эндотелия, что приводит к неоангиогенезу [7].

IL-36 в коже синтезируют преимущественно кератиноциты, в отличие от IL-17A и IL-23, экспрессируемые в основном иммунокомпетентными клетками. Таким образом, ожидается, что локальное ингибирование IL-36 будет в значительно меньшей степени влиять на системные иммунные процессы и улучшит профиль безопасности.

В данной работе нами впервые было проведено исследование топического таргетного препарата – ингибитора сериновых протеаз, терапевтический эффект которого направлен на подавление активности IL-36. Преимуществом выбора данной точки воздействия является возможность контролировать воспалительный процесс при псориазе на ранних этапах его развития. Стоит отметить высокую селективность, топическую форму препарата, относительную дешевизну и простоту производства химического соединения [8].

В работе на классической лабораторной модели «имиквимод-индуцированный псориаз» показано выраженное клиническое улучшение состояния кожи при использовании препарата сивелестат, что проявилось в снижении интенсивности эритемы, шелушения и толщины кожи. При гистологическом исследовании установлено, что толщина эпидермиса уменьшилась до 3-х раз. Выраженность акантоза, гиперкератоза и лимфогистиоцитарного инфильтрата также сократилась. Объективным критерием эффективности сивелестата являются результаты непрямого иммуногистохимического исследования. Показано, что количество Т-лимфоцитов (CD3+-клетки) в коже при лечении препаратом сивелестат уменьшилось в 1,8-2,2 раза, а пролиферативная активность клеток эпидермиса (число Ki-67+-клеток) снизилась в 2,3-2,9 раза. Более выраженная клиническая эффективность крема сивелестат по сравнению с мазью требует проведения дальнейшего изучения.

При сравнении клинических и гистологических изменений не обнаружено достоверных отличий между группами Акридерм и сивелестат крем. В то же время результаты непрямого иммуногистохимического исследования (маркеры CD3 и Ki67) показали более выраженное снижение уровня Т-лифоцитов и пролиферативной активности клеток кожи в группе топического глюкокортикостероидного препарата, что можно объяснить его сильным вазоконстрикторным эффектом.

Подавление активности IL-36-опосредованного воспаления в коже посредством топических ингибиторов сериновых протеаз является новым перспективным направлением в лечении больных псориазом. Это позволит усовершенствовать подходы к лечению как ограниченных, так и распространенных форм заболевания.

Ограничения исследования

Ограничения исследования могут быть связаны с формированием модели имиквимод-индуцированного псориаза, оценкой клинических, гистологических и иммуногистохимических характеристик. Необходимо проведение клинических исследований для оценки эффективности действия и безопасности препарата у больных псориазом.

Заключение

На лабораторной модели имиквимод-индуцированного псориаза установлено, что ингибитор сериновых протеаз (сивелестат) обладает клинической эффективностью сравнимой с сильным топическим глюкокортикостероидным препаратом. Показано выраженное разрешение элементов кожной сыпи: эритемы, индурации и шелушения, а также их суммарного показателя – индекса mPASI; значительное снижение воспалительных изменений в коже (сокращение толщины эпидермиса и численности лимфогистиоцитарного инфильтрата); снижение инфильтрации кожи Т-лимфоцитами и нормализация скорости деления клеток эпидермиса и дермы.

About the authors

Alexander S. Zhukov

Military Medical Academy named after S. M. Kirov

Author for correspondence.
Email: doctor-vma@mail.ru

MD, cand. (sci.)

Россия, Saint-Petersburg

Evgeny R. Zharun

Military Medical Academy named after S. M. Kirov

Email: dkkillq@mail.ru
Россия, Saint-Petersburg

Vladislav R. Khairutdinov

S.M. Kirov Military Medical Academy

Email: haric03@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-0387-5481
SPIN-code: 4417-9117
Scopus Author ID: 35784481400
ResearcherId: A-7186-2016

MD, dr. sci. (med.), assistant professor

Россия, Saint Petersburg

Alexey V. Samtsov

S.M. Kirov Military Medical Academy

Email: avsamtsov@mail.ru
SPIN-code: 2287-5062

MD, dr. sci. (med.); professor

Россия, Saint Petersburg

Mihail Yu. Krasavin

Saint Petersburg University

Email: krasavintm@gmail.com

MD, dr. (sci.) med, professor

Россия, Saint Petersburg

A. V. Garabagiou

Saint Petersburg State Institute of Technology (Technical University)

Email: gar-54@mail.ru

MD, dr. (sci.) med, professor

Россия, Saint Petersburg

References

Supplementary files