Development and research of a model for differential diagnosis of latent late syphilis and false-positive serological reactions on immunochips with a panel of 12 Treponema pallidum antigens

Full Text

По официальным статистическим данным заболеваемость сифилисом в Российской Федерации стабильно снижается. Так, в 2018 году показатель заболеваемости сифилисом в целом составил 16,7 на 100 тысяч населения, однако в общей структуре доля поздних форм, в том числе скрытого позднего сифилиса, сохраняется на высоком уровне [1].

Основными методами для диагностики сифилиса являются серологические лабораторные тесты, выявляющие антитела к возбудителю сифилиса (Treponema pallidum) в сыворотке крови [2]. В России к числу регламентированных серологических методов исследования крови относят нетрепонемные тесты (НТТ) – реакцию микропреципитации (РМП) или ее аналоги, такие как тест быстрых плазменных реагинов (РПР), тест Исследовательской лаборатории венерических заболеваний (Venereal Disease Research Laboratorytest, VDRL) и трепонемные тесты (ТТ) – иммуноферментный анализ (ИФА), реакцию пассивной гемагглютинации (РПГА), реакцию иммунофлюоресценции (РИФ) в модификациях РИФабс и РИФ200, реакцию иммобилизации бледных трепонем (РИБТ), метод иммунохемилюминесценции (ИХЛ) и метод иммунохроматографии (ИХГ) [2, 3].

Скрытый поздний сифилис характеризуется отсутствием клинических проявлений, поэтому для установления этого диагноза используют анамнестические данные с указанием на вероятное заражение более 2 лет назад, когда пациент мог отмечать клинические проявления, сходные с симптомами раннего сифилиса, отсутствие указаний на лечение сифилиса в прошлом, а также отсутствие, как правило, сифилиса у половых партнеров. Однако решающее значение для установления диагноза скрытого позднего сифилиса имеют лабораторные серологические методы исследования. По литературным данным [2, 4 - 6] чувствительность нетрепонемных тестов недостаточно высока и при скрытых формах сифилиса варьирует от 30 до 75%, трепонемные серологические реакции, напротив, обладают более высокой чувствительностью, в зависимости от вида теста и стадии сифилиса от 70 до 100%. Вместе с тем, на практике при применении спектра разнообразных лабораторных методов, нередко возникает ряд проблем связанных с несовпадением результатов отдельных исследований, что может приводить к несвоевременному выявлению случаев скрытых и поздних форм сифилиса. Одной из причин расхождения результатов серологических реакций на сифилис могут быть различия сроков их позитивации и негативации, связанные с особенностями развития иммунного ответа при сифилисе [7]. Кроме того, при расхождении результатов лабораторных тестов: противоречивых, сомнительных, нередко слабоположительных результатах серологических реакций, а также при изолированной позитивности одного теста среди отрицательных других и колебаний результатов тестов в повторных исследованиях, возникает необходимость проведения дифференциальной диагностики с ложноположительными, или неспецифическими серологическими реакциями на сифилис, выявляющихся у лиц, не страдающих сифилитической инфекцией и не болевших сифилисом в прошлом [2, 7].

Ложноположительные результаты серологических реакций на сифилис могут наблюдаться во время беременности, при многих инфекционных заболеваниях, при аутоиммунных заболеваниях, системных болезнях соединительной ткани, онкологических заболеваниях, хронической патологии печени и желчевыводящих путей, при сердечно-сосудистой и эндокринной патологии, при заболеваниях крови, при хронических заболеваниях легких, при инъекционном применении наркотиков, в старческом возрасте  [2, 7 - 13]. Кроме того, одной из причин ложноположительных тестов на сифилис являются технические погрешности, сопровождающие сбор, доставку, хранение образцов сыворотки крови и постановку серологических реакций, а также низкое качество применяемых диагностикумов [2, 7, 14]. Для дифференциальной диагностики различных форм сифилитической инфекции и ложноположительных серологических реакций на сифилис используют комплекс клинико-анамнестических и лабораторных критериев, а также новые технологии, основанные на применении математических алгоритмов и многофакторного дискриминантного анализа [2, 7, 15-17].

Одним из основных направлений современной медицины является мультиплексная диагностика, которая предполагает одновременное определение множества различных аналитов в одном образце. При разработке систем для комплексного выявления маркеров инфекционных заболеваний перспективным подходом представляется использование технологии микрочипов (биочипов). Относительно недавно разработан иммуночип для трепонема-специфической серологической диагностики сифилиса на основе определения антител двух классов к 10 и к 12 рекомбинантным антигенам T. pallidum [18-19]. Для дифференциации скрытых форм сифилиса на основе исследования уровня иммуноглобулинов классов IgG и IgM в сыворотке крови на иммуночипе с 12 антигенами T. pallidum описано применение метода линейного дискриминантного анализа  [19].

Целью настоящего исследования была разработка решающего правила [20] разделения пациентов со скрытым поздним сифилисом и с ложноположительными серологическими реакциями на сифилис методом дискриминантного анализа на основе результатов исследования на иммуночипах уровней антител двух классов к 12 рекомбинантными антигенами T. pallidum в сыворотке крови.

Материалы и методы

Уровень антител классов IgG и IgM исследовали на иммуночипах с 12 рекомбинантными антигенами T. pallidum: Тр15, Тр17, Тр47 и TmpA (Имтек, Россия), традиционно применяемыми для трепонема-специфической диагностики сифилиса, Тр0163 и Тр0971 (Cusabio, Китай), отобранными на основе биоинформатического анализа протеома T. pallidum [21], а также Тр0453, Тр0319, Тр1038, Тр0965, Тр0277,  Тр0684, полученными путем клонирования и гетерологической экспрессии в клетках E. coli [18].

Иммуночипы были изготовлены с использованием технологии сополимеризационной иммобилизации в ООО «Биочип ИМБ» на базе Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН. Каждый рекомбинантный белок в смеси гель-образующих полимеров наносили на активированную (bind-silane) поверхность стеклянного слайда в четырех повторах. Кроме белков T. pallidum на поверхность слайда наносили контрольные элементы: смесь гель-образующих полимеров как контроль фоновой реакции; раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) (Диаэм, Россия) для контроля неспецифического связывания; IgG и IgM человека (Thermo, США) для контроля связывания вторичных антител; антитела козы против иммуноглобулинов человека (анти-IgG и анти-IgM) (KPL, США) для контроля внесения исследуемого образца сыворотки. Границы печати маркировали флуоресцентными красителями Су5 и Су3. После завершения процесса печати иммуночипы промывали в фосфатно-солевом буфере c 0,05% Tween-20, реакционную область блокировали 1% раствором поливинилового спирта в том же буфере и высушивали в потоке воздуха. Область печати закрывали пластиковой реакционной камерой.

Образцы сыворотки крови в разведении 1:10 вносили в реакционную камеру иммуночипа в фосфатно-солевом буфере (1х PBS) с 0,05% Tween-20 и инкубировали 12 ч при 37°С. Несвязавшийся материала отмывали 1xPBS с 0,05% Tween 20. С иммуночипа удаляли реакционную камеру и на поверхность наносили вторичные антитела к иммуноглобулину IgG человека, меченые флуоресцентным красителем Cy5 и антитела к иммуноглобулину IgM человека, меченые флуоресцентным красителем Cy3.  Чипы инкубировали в течение 1 ч при 37°С, промывали деионизированной водой и высушивали в потоке воздуха. Визуализацию результатов исследования проводили на аппаратно-программном комплексе для анализа биочипов (ООО «Биочип ИМБ», Россия), регистрирующего интенсивность флуоресцентного сигнала флуорохромов Cy5 и Cy3. Интенсивность флуоресценции для каждого антигена рассчитывали как средний сигнал от 4 повторных ячеек с данным антигеном за вычетом среднего фонового значения данного иммуночипа (ячейки контроля фона). Интенсивность флуоресценции выражают в условных единицах.

Объектом исследования были образцы сывороток крови больных поздним скрытым сифилисом (n=34) и пациентов с ложноположительными реакциями (ЛПР) на сифилис (n=31). Диагноз был установлен на основании клинико-анамнестического и серологического обследования пациентов в соответствии с использованием общепринятых критериев верификации сифилиса (МКБ 10) и клиническими рекомендациями «Сифилис» Министерства здравоохранения РФ [2].

Статистическую обработку результатов выполняли с помощью программного пакета Statistica 13.0. Для дифференциальной диагностики больных поздним скрытым сифилисом (ПСС) и пациентов с ложноположительными реакциями (ЛПР) применяли метод линейного дискриминантного анализа, цель которого состоит в построении решающего правила, позволяющего наилучшим образом отделить одну группу исследуемых от другой, а также в идентификации новых пациентов и отнесении их к уже имеющимся группам.

Для проведения дискриминантного анализа использовали результаты, полученные методом непрямой реакции иммунофлуоресценции (нРИФ) на иммуночипе, а именно значения флуоресценции антител классов IgG и IgM при взаимодействии исследованных сывороток с 12 рекомбинантными антигенами T. pallidum (всего 24 показателя).

Результаты

Для построения диагностической модели из сывороток крови пациентов с ПСС и ЛПР на сифилис были сформированы две выборки – обучающая (n=59) и тестовая (n=6). Обучающая выборка содержала 30 образцов сывороток больных с диагнозом ПСС и 28 - пациентов с ЛПР. В состав тестовой выборки входили по 3 образца сывороток пациентов каждой группы. Поиск решающего правила проводили по элементам обучающей выборки. Уровень значимости (р), при котором результаты объявляются статистически значимыми, установлен равным 0,05.

В результате процедуры пошагового отбора на основе обучающей выборки в оптимальное множество наиболее информативных признаков были включены 8 дискриминантных переменных из 24, информативность признаков которых указана в таблице 1.

 

Таблица 1. Итоги анализа дискриминантных функции для двух групп / Table 1. Discriminant function analysis results for two groups     

	Лямбда Уилкса: ,13098 прибл. F (8,50)=41,468  p<0,0000
n=59	Лямбда Уилкса	Частичная лямбда	F-искл (1,50)	p-уров
Tp17G	0,242756	0,539545	42,67072	0,000000
Tp0453G	0,179758	0,728635	18,62144	0,000075
Tp1038M	0,187491	0,698581	21,57365	0,000025
Tp0971G	0,196688	0,665918	25,08434	0,000007
Tp0319G	0,147593	0,887428	6,34260	0,015033
Tp0163G	0,160056	0,818327	11,10028	0,001629
TmpAG	0,146914	0,891525	6,08367	0,017115
Tp0163M	0,141958	0,922652	4,19160	0,045897

 

        

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Дискриминация между группами высокозначима (общая статистика лямбда Уилкса=0,13; F=41,468; p-level<0,00001), что свидетельствует о высокой чувствительности выбранной модели. Значение статистик лямбда Уилкса и F-искл. для каждой переменной характеризуют её вклад в общую дискриминацию (чем больше  эти значения, тем больше вклад). Из таблицы видно, что наибольший вклад вносит переменная Тр17 IgG - уровень флуоресценции антител класса IgG при взаимодействии с антигеном Тр17 на иммуночипе. Следующая по значимости переменная Tp0971 IgG и т.д.

На следующем этапе дискриминационного анализа наиболее информативные переменные, отобранные на основании обучающей выборки, были использованы для вычисления  функций классификации.Функции классификации рассчитываются для каждой группы пациентов и используются для их дифференциации. В таблице 2 приведены коэффициенты и константы классификационных уравнений к 8 переменным, вошедшим в окончательную модель.

 

Таблица 2. Коэффициенты и константы классификационных функций для дифференциации пациентов с ППС и ЛПР/ Table 2. Coefficients and constants of classification functions for differentiation groups of latent stages of syphilis and false positive serological tests

Переменные линейных классификационных функций	Коэффициенты классификационных уравнений
	ПСС	ЛПР
Tp17 IgG	0,0138	0,00030
Tp0453 IgG	-0,0097	0,00125
Tp1038 IgM	0,1562	-0,01989
Tp0971 IgG	0,0162	0,00026
Tp0319 IgG	-0,0039	0,00247
Tp0163 IgG	0,0061	-0,00185
TmpA IgG	-0,0094	0,00224
Tp0163 IgM	-0,0291	0,02035
Tp0277 IgG	0,0057	-0,00706
Константа	-13,8784	-1,85152

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

С учётом данных таблицы 2 функции классификации (решающее правило) для отнесения пациентов к группе   с ПСС или с ЛПР на основании  исследования сывороток методом нРИФ на иммуночипах имеют следующий вид:

ПСС = 0,0138*Tp17 IgG -0,0097*Tp0453 IgG + 0,1562*Tp1038 IgM + 0,0162*Tp0971 IgG–  - 0,0039*Tp0319 IgG + 0,0061*Tp0163 IgG – 0,0094*TmpAIgG - 0,0291*Tp0163 IgM +0,0057*Tp0277 IgG – 13,8784

ЛПР = 0,0003*Tp17 IgG +0,00125*Tp0453 IgG - 0,01989*Tp1038 IgM + 0,00026*Tp0971 IgG + 0,00247*Tp0319 IgG - 0,00185*Tp0163 IgG + 0,00224*TmpAIgG + 0,02035*Tp0163 IgM - 0,00706*Tp0277 IgG – 1,85152

Пациент должен получить тот диагноз, которому соответствует большее значение классификационного уравнения.

Качество разработанной классификации оценивалось с помощью классификационной матрицы (табл.3). Матрица содержит информацию о количестве и проценте корректно классифицированных случаев. Строки матрицы — исходные случаи, столбцы – предсказанные. Для обучающей выборки модель показала 100% результативность.

 

Таблица 3. Классификационная матрица для обучающей выборки / Table 3. Training sample classification matrix

	ПСС	ЛПР	Корректно классифицировано (%)
ПСС	31	0	100
ЛПР	0	28	100
Результативность			100

 

 

 

 

 

 

 

 

Для выборки, по которой была проведена оценка дискриминирующей функции, классификация всегда действует лучшим образом. Поэтому качество работы решающего правила было испытано на тестовой выборке. Для этого к 59 пациентам обучающей выборки были добавлены 6 пациентов тестовой без указания группы. В результате классификации один из образцов сыворотки больного с ПСС был ошибочно отнесён к группе пациентов с ЛПР. Коэффициент результативности для тестовой выборки составил более 86% (таблица 4). Эти данные говорят о том, что получена хорошая дискриминантная модель.

 

Таблица 4. Классификационная матрица для тестовой выборки. / Table 4. Squared Mahalanobis distance between groups

	ПСС	ЛПР	Корректно классифицировано (%)
ПСС	2	1*	67
ЛПР	0	3	100
Результативность			86,8

 

 

 

 

 

 

 

Примечание: Звёздочкой отмечены неправильно классифицированные образцы

 

Заключение

В работе был выполнен статистический анализ результатов исследования на иммуночипах уровней антител двух классов к 12 рекомбинантными антигенами T. pallidum в сыворотках пациентов с ПСС и ЛПР; разработан метод классификации изучаемых групп на основе статистических методов (решающее правило); проведена оценка информативности переменных в модели и качества разработанной процедуры классификации. Показано, что метод дискриминантного анализа позволяет создавать достаточно достоверные математические модели, которые могут быть использованы в классификации.

About the authors

Marina V. Shpilevaya

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology

Author for correspondence.
Email: Aniram1970@list.ru

сand. sci. (biol.), senior researcher associate

Россия, Moscow

Georgiy L. Katunin

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology

Email: g.katunin@rambler.ru

dermatovenereologist, MD, сand. sci

Россия, Moscow

Alexey A. Kubanov

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology

Email: kubanov@list.ru

MD, dr. sci. (med.), professor, corresponding member of the Russian Academy of Sciences

Россия, Moscow

References

Supplementary files