Deficient skin proteins rescue of expression in patients with epidermolysis bullosa: efficacy of gentamicin

Olga G. Artamonova; Артамонова Ольга Григорьевна; Arfenya E. Karamova; Карамова Арфеня Эдуардовна; Alexey A. Kubanov; Кубанов Алексей Алексеевич; Vadim V. Chikin; Чикин Вадим Викторович; Ekaterina S. Monchakovskaya; Мончаковская Екатерина Сергеевна

doi:10.25208/vdv16737

Deficient skin proteins rescue of expression in patients with epidermolysis bullosa: efficacy of gentamicin

Authors: Artamonova O.G.¹, Karamova A.E.¹, Kubanov A.A.¹, Chikin V.V.¹, Monchakovskaya E.S.¹
Affiliations:
1. State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology
Issue: Vol 100, No 1 (2024)
Pages: 24-30
Section: REVIEWS
Submitted: 01.11.2023
Accepted: 30.01.2024
Published: 18.03.2024
URL: https://vestnikdv.ru/jour/article/view/16737
DOI: https://doi.org/10.25208/vdv16737
ID: 16737

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Epidermolysis bullosa is a group of rare hereditary skin diseases based on mutations in the genes of structural proteins of the epidermis and the dermal-epidermal junction. Clinically, epidermolysis bullosa is characterized by the appearance of erosions and blisters on the skin and mucous membranes in response to any minor impact. Currently, the treatment of epidermolysis bullosa is only symptomatic. Pathogenetic methods of the epidermolysis bullosa therapy are under development. One of the new possible pathogenetic directions in the treatment of epidermolysis bullosa is aminoglycoside antibiotics (gentamicin, geneticin, paromomycin). A number of studies have shown the ability of gentamicin to promote readthrough terminating codon and resume the synthesis of type VII collagen in keratinocytes and fibroblasts in patients with epidermolysis bullosa with nonsense mutations in the COL7A1. The review presented the possibilities of gentamicin therapy for patients with epidermolysis bullosa, describes the mechanism of its action, summarizes data from clinical trials.

Keywords

epidermolysis bullosa, collagen VII, gentamicin, nonsense mutations, COL7A1

Full Text

Введение

Врожденный буллезный эпидермолиз (БЭ) — группа редких наследственных заболеваний кожи, в основе которых лежат мутации генов структурных белков эпидермиса и дермо-эпидермального соединения. Клиническая картина врожденного БЭ представлена пузырями и/или эрозиями на коже и слизистых оболочках, образующихся в ответ на незначительную механическую травму [1].

У больных врожденным БЭ выявлено более 700 мутаций: миссенс-мутации, нонсенс-мутации, делеции, мутации рамки считывания, инсерции, мутации сайта сплайсинга [2]. Тяжесть течения и выраженность клинических проявлений врожденного БЭ определяются характером мутации. Мутации происходят в генах, отвечающих за синтез структурных белков эпидермиса и дермо-эпидермального соединения: KRT5, KRT14, DSP, PKP1, PLEC, ITGA6, ITGB4, LAMB3, LAMA3, LAMC2, COL17A1, COL7A1 и KIND1. Тяжелое течение болезни отмечается при пограничном и дистрофическом БЭ, синдроме Киндлер, при которых нарушается синтез структурных белков кожи коллагена VII и XVII типов, ламинина-332, α6β4-интегрина и киндлина, отвечающих за прочность соединения клеток эпидермиса и базальной мембраны, что приводит к образованию длительно незаживающих эрозий и язв даже при незначительном травмировании [3]. Длительно незаживающие эрозивно-язвенные дефекты — предрасполагающие факторы развития плоскоклеточного рака кожи, который, в свою очередь, является частой причиной смертности данной группы больных [4].

Наиболее тяжелые проявления врожденного БЭ ассоциируются с нонсенс-мутациями. Так, от 10 до 25% вызывающих заболевание мутаций гена COL7A1, кодирующего коллаген VII типа, — основной компонент якорных фибрилл, структур, отвечающих за прикрепление эпидермиса к дерме в дермо-эпидермальном соединении, представляют собой нонсенс-мутации [5, 6]. Эти мутации приводят к появлению стоп-кодона и преждевременной терминации синтеза белка, необходимого для построения якорных фибрилл. Прекращение его выработки ведет к значительному уменьшению сопротивляемости кожи и слизистых оболочек даже к минимальным механическим нагрузкам.

В настоящее время все методы терапии врожденного БЭ являются симптоматическими и направлены на ускорение заживления эрозивно-язвенных дефектов кожи и слизистых оболочек, предотвращение развития вторичной инфекции, коррекцию осложнений и сопутствующей патологии [7]. Патогенетические подходы в лечении врожденного БЭ находятся на различных этапах разработки и внедрения. К перспективным относят исследования в области белковой, клеточной и генной терапии [8, 9]. Общая цель методов терапии больных врожденным БЭ — восстановление продукции структурных белков эпидермиса и ускорение заживления эрозивно-язвенных дефектов.

Одной из особенностей БЭ является мозаицизм, который заключается в конкурентном размножении клеток при спонтанном возникновении рекуррентной мутации и восстановлении непрерывной рамки считывания нормального транскрипта мутантного белка. Фенотипически ревертантный мозаицизм проявляется в виде образования участков здоровой кожи в местах эрозивно-язвенных поражений кожи [10]. Способность восстановить в клетке синтез нормального транскрипта мутантного белка была показана для антибиотиков группы аминогликозидов, которые, воздействуя на активный центр рибосомы, осуществляют сквозное прочитывание стоп-кодонов, в том числе возникающих при мутациях в структурных белках кожи.

Механизм действия гентамицина на уровень экспрессии коллагена VII типа заключается в сквозном прочитывании стоп-кодона посредством связывания со специфическим участком рРНК и нарушении взаимодействия кодона с антикодоном в области аминоацил-тРНК-связывающего участка, тем самым приводя к образованию полноразмерного белка у больных врожденным БЭ [11]. В эксперименте in vitro продемонстрирована также способность гентамицина восстанавливать синтез ламинина-332 у больных пограничным БЭ с выявленными нонсенс-мутациями [12]. Основными компонентами гентамицинового комплекса выступают гентамицины группы С — С1, С1а и С2. Считается, что их содержание в гентамициновом комплексе составляет около 80%, а антибиотическая активность в отношении микроорганизмов практически одинакова. Гентамицины группы С наиболее значимы для антибактериальной терапии, так как обладают повышенной устойчивостью к действию ферментов, инактивирующих аминогликозиды, что обеспечивает их эффективность против микроорганизмов, устойчивых к канамицину. Остальные 20% приходятся на минорные компоненты, к которым относят гентамицины группы А, гентамицины группы В, гентамицин Х и ряд других. Минорные компоненты гентамицинового комплекса имеют гидроксильные группы при атомах углерода в положениях 3' и 4', снижающие эффективность антибиотиков, вследствие чего они не представляют интереса для лечебной практики. Однако именно минорный компонент гентамицин Х2 был идентифицирован как индуцирующий считывание стоп-кодона [13].

Гентамицин в терапии наследственных заболеваний с нонсенс-мутациями

Более 1800 наследственных заболеваний человека вызвано нонсенс-мутациями, приводящими к формированию преждевременного стоп-кодона и прекращению синтеза функционального белка. Согласно базе данных мутаций генов человека (The Human Gene Mutation Database), 12% всех зарегистрированных мутаций являются нонсенс-мутациями [5].

В целом ряде исследований in vitro и in vivo показано, что аминогликозидные антибиотики могут подавлять преждевременную терминацию и способствовать синтезу первичного полноразмерного белка при таких генетических заболеваниях, как муковисцидоз, мышечная дистрофия Дюшенна, гемофилия, спинальная мышечная атрофия и др. [11, 14–17].

Так, в открытом исследовании I. Sermet-Gaudelus и соавт. (2007) [14] показано, что внутривенное введение гентамицина больным с муковисцидозом приводило к улучшению респираторного статуса. Доказано, что in vitro аминогликозидные антибиотики (гентамицин) подавляют нонсенс-мутации, локализованные в гене, кодирующем белок регулятора трансмембранной проводимости муковисцидоза (CFTR), позволяя продолжить трансляцию до естественного стоп-кодона. Терапия аминогликозидами признана мутационно-специфичной и перспективной у больных наследственными заболеваниями с нонсенс-мутациями.

Гентамицин в терапии врожденного буллезного эпидермолиза

В 2014 г. J. Cogan и соавт. [18] впервые обнаружили способность антибиотиков из группы аминогликозидов (генетицина, гентамицина и паромомицина) способствовать сквозному прочитыванию стоп-кодонов и индуцировать синтез коллагена VII типа в клеточных линиях кератиноцитов и фибробластов, выделенных от больных рецессивным дистрофическим БЭ с нонсенс-мутациями в гене COL7A1. В кожных лоскутах, выращенных в лабораторных условиях, синтезированный коллаген VII типа путем сквозного прочитывания стоп-кодона аминогликозидами встроился в зону дермо-эпидермального соединения в функционально активном состоянии. Гентамицин способствовал сквозному прочитыванию стоп-кодона посредством связывания со специфическим участком рРНК, нарушая взаимодействие кодона с антикодоном в области аминоацил-тРНК-связывающего участка, тем самым возобновляя образование первичного полноразмерного белка. Результаты исследования подтвердили потенциальную возможность применения аминогликозидов в терапии больных с рецессивным дистрофическим БЭ и другими наследственными заболеваниями кожи, вызванными нонсенс-мутациями.

В 2017 г. D.T. Woodley и соавт. [11] представили результаты двойного слепого плацебо-контролируемого пилотного исследования, где оценивалась без- опасность и эффективность местного и внутрикожного применения гентамицина у 5 пациентов с рецессивным дистрофическим БЭ с нонсенс-мутациями. Проведенное иммунофлюоресцентное антигенное картирование (ИАК) после топического применения и внутрикожного введения гентамицина у больных врожденным БЭ показало повышение экспрессии коллагена VII в области дермо-эпидермального соединения. В то же время после применения плацебо-препаратов уровень экспрессии коллагена VII не изменился.

V. Lincoln и соавт. (2018) опубликовали данные экспериментов in vitro, где гентамицин способствовал восстановлению синтеза ламинина-332 при пограничном БЭ [12]. С помощью иммуноблота, иммунофлуоресцентной микроскопии и создания 3D-модели, эквивалентной коже, in vitro было показано, что синтез ламинина-β3, индуцированный гентамицином, приводил к восстановлению сборки, секреции и отложения ламинина-332 в области дермо-эпидермального соединения, а также к правильной поляризации интегрина-α6β4 в базальных кератиноцитах.

Y. Li и соавт. (2020) представили клиническое наблюдение пациента в возрасте 6 месяцев со среднетяжелым генерализованным пограничным БЭ [19]. Больному было назначено топическое применение 0,3% мази с гентамицином ежедневно в течение 3 месяцев совместно с плацебо-препаратом. Авторы наблюдали ускорение заживления эрозий, уменьшение возникновения пузырей в месте применения гентамицина и ухудшение на фоне применения плацебо. Наблюдалось восстановление экспрессии коллагена XVII типа при проведении ИАК. В течение 2 месяцев после применения гентамицина наблюдалась ремиссия. Кроме того, 3 пациентам с тяжелым генерализованным пограничным БЭ с нонсенс-мутациями в генах LAMA3 и LAMB3 в течение 2 недель наносили 0,5% мазь с гентамицином 2 раза/ сут на дно эрозий/язв. Период наблюдения составил 3 месяца. Клинически наблюдалось ускорение заживления. По результатам ИАК экспрессия ламинина-332 восстановилась. Образования антител к ламинину-332 в крови и коже не наблюдалось [19].

В работе J. Hammersen и соавт. (2019) больным тяжелым генерализованным пограничным БЭ в возрасте от 2,0 до 6,5 месяца внутривенно и внутримышечно вводили раствор гентамицина в дозе 7,5 мг/кг/сут в течение 3 месяцев [20]. Наблюдалось ускорение заживления эрозий, уменьшение возникновения пузырей у всех пациентов, кроме одного (у 1 пациента отмечалось ухудшение). По результатам ИАК была выявлена минимальная экспрессия ламинина-332.

J.H. Hung и соавт. (2021) наблюдали больную пограничным БЭ с 2 мутациями (нонсенс-мутация и мутация сайта сплайсинга) в гене LAMB3 [21]. В течение 1 недели пациентке наносили 0,3% мазь с гентамицином 1 раз/сут на дно эрозий/язв. Клинически наблюдалось ускорение заживления. По результатам ИАК на 7-е сутки экспрессия ламинина-332 восстановилась.

В работе K. Osipowicz и соавт. (2020) [22] 4 пациентам с тяжелым генерализованным рецессивным дистрофическим БЭ с мутациями в гене COL7A1 (нонсенс-мутация и мутация сайта сплайсинга) в течение 4 недель проводилось полоскание полости рта 0,3% раствором гентамицина 2 раза/сут. Клинически наблюдалось ускорение заживления и сокращение площади эрозий в полости рта в 2 раза. По результатам ИАК экспрессия коллагена VII типа восстановилась.

L. Martínez-Santamaría и соавт. (2022) представили клиническое наблюдение пациентки с простым БЭ и мышечной дистрофией с нонсенс-мутацией в гене PLEC1, кодирующей плектин [23]. Пациентке провели 2 курса внутривенных инъекций гентамицина по 7,5 мг/ кг ежедневно в течение 14 дней с периодом наблюдения 120 и 150 дней соответственно. После лечения гентамицином экспрессия плектина в биоптатах кожи сохранялась в течение, как минимум, 5 месяцев. Нежелательные явления не зарегистрированы.

Клинические исследования с применением гентамицина у больных врожденным буллезным эпидермолизом

В 2022 г. были опубликованы данные открытого пилотного нерандомизированного клинического исследования [24]. Оно включало в себя 5 пациентов: 2 больных со среднетяжелым генерализованным пограничным БЭ и 3 — с тяжелым генерализованным пограничным БЭ с нонсенс-мутациями в генах LAMA3 и LAMB3. Двум пациентам вводили 7,5 мг/кг раствора гентамицина ежедневно в течение 14 дней, 3 пациентам — 10 мг/ кг раствора гентамицина 2 раза/сут в течение 24 дней. Через 1 месяц наблюдалось сокращение площади эрозий на 50%, через 3 месяца — на 85%. Период наблюдения составил 3 месяца. По результатам ИАК экспрессия ламинина-332 восстановилась. Образования антител к ламинину-332 в крови и коже не наблюдалось. Нежелательные явления не зарегистрированы.

Представлены данные завершенного клинического исследования, направленного на применение гентамицина у больных врожденным БЭ: «Терапия гентамицином пациентов с рецессивным дистрофическим БЭ с нонсенс-мутациями (Gentamicin Therapy for Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa Patients with Nonsense Mutations)» [25].

В исследование было включено 5 пациентов в возрасте от 8 до 31 года с рецессивным дистрофическим БЭ с нонсенс-мутациями. Всем пациентам применялся гентамицин — наружно в виде мази и в виде раствора для внутрикожного введения, а также плацебо. 0,1% мазь с гентамицина сульфатом и мазевая основа (плацебо) применялась 3 раза/сут в течение 2 недель на две неинфицированные эрозии. Внутрикожное введение раствора гентамицина в дозе 8 мг/сут и плацебо выполнялись в область непораженной кожи в течение 2 дней. Период наблюдения составил 1 и 3 месяца соответственно. Нежелательных реакций зарегистрировано не было. Результаты наружного применения гентамицина продемонстрировали улучшение заживления, уменьшение числа эрозий в сравнении с плацебо.

В настоящее время в США проводится клиническое исследование «Внутривенная терапия гентамицином при рецессивном дистрофическом БЭ (Intravenous Gentamicin Therapy for Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa)» [26]. Цель исследования — оценить безопасность и эффективность внутривенного введения гентамицина у больных рецессивным дистрофическим БЭ. Исследователи полагают, что внутривенное введение позволит одномоментно воздействовать на все имеющиеся у пациента эрозии/язвы, в отличие от топического применения гентамицина.

Критериями включения в исследование являются: пациенты с рецессивным дистрофическим БЭ в возрасте 7 лет и старше, пациенты с рецессивным дистрофическим БЭ и пациенты с установленной нонсенс-мутацией в гене COL7A1, снижение или отсутствие экспрессии коллагена VII типа в биоптатах кожи больных рецессивным дистрофическим БЭ, культивированные фибробласты из кожи больных рецессивным дистрофическим БЭ, способные продуцировать полноценные альфа-цепи 290 kDa коллагена VII с добавлением гентамицина 400 мг/мл в культуре/среде, возможность сидеть или лежать в течение 30 мин для внутривенных инъекций. Критериями исключения являлись: применение гентамицина в течение 6 недель до начала исследования, нарушение слуха, заболевания почек, беременность или лактация, применение лекарственных препаратов с ото- и нефротоксичностью, участие в другом клиническом исследовании, целью которого является повышение экспрессии коллагена VII типа, с применением системных препаратов.

В исследование планируется включить 9 больных: 6 пациентов (3 взрослых и 3 детей) будут получать гентамицин внутривенно (7,5 мг/кг) ежедневно в течение 14 дней. Трое взрослых пациентов будут получать гентамицин внутривенно (7,5 мг/кг) раз в 2 недели в течение 3 месяцев. Период наблюдения — 6 месяцев. Планируется оценивать экспрессию коллагена VII типа в биоптатах кожи больных рецессивным дистрофическим БЭ.

Исследование продолжается, его результаты на сегодняшний день не опубликованы.

Заключение

В настоящее время результаты экспериментальных и клинических исследований применения антибиотиков из группы аминогликозидов (генетицина, гентамицина и паромомицина) у больных врожденным БЭ с нонсенс- мутациями доказывают их возможность способствовать сквозному прочитыванию стоп-кодонов и индуцировать синтез коллагена VII типа в клеточных линиях кератиноцитов и фибробластов. Эффективность такой терапии подтверждена результатами ИАК. Дальнейшие разработка и совершенствование применения нонсенс-супрессивной терапии аминогликозидами может привес- ти к созданию нового, неинвазивного метода лечения пациентов с врожденным БЭ, несущих нонсенс-мутации, что позволит улучшить качество жизни таких пациентов, отсрочить развитие плоскоклеточного рака кожи и увеличить продолжительность жизни.