Evaluation of recombinant proteins T. pallidum Тр0163 and Тр0971 as antigens for the diagnosis of syphilis using enzyme immunoassay.

Natalia V. Arbuzova; Арбузова Наталья Владимировна; Marina V. Shpilevaya; Шпилевая Марина Валентиновна; Georgii L. Katunin; Катунин Георгий Леонидович; Oleg E. Kuznetsov; Кузнецов Олег Евгеньевич; Nikita Y. Nosov; Носов Никита Юрьевич; Victoria S. Solomka; Соломка Виктория Сергеевна

doi:10.25208/vdv16813

Evaluation of recombinant proteins T. pallidum Тр0163 and Тр0971 as antigens for the diagnosis of syphilis using enzyme immunoassay.

Authors: Arbuzova N.V.¹, Shpilevaya M.V.¹, Katunin G.L.¹, Kuznetsov O.E.¹, Nosov N.Y.¹, Solomka V.S.¹
Affiliations:
1. Federal State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology
Section: ORIGINAL STUDIES
Submitted: 01.08.2024
Accepted: 20.11.2024
Published: 25.11.2024
URL: https://vestnikdv.ru/jour/article/view/16813
DOI: https://doi.org/10.25208/vdv16813
ID: 16813

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Background: Many T.pallidum proteins have been evaluated for their diagnostic value. However, there are difficulties in diagnosing asymptomatic forms of syphilis, when sensitivity of serologic methods may vary considerably. Therefore, the search for more sensitive and specific antigens for the serological diagnosis of syphilis continues.

Purpose of the study: To evaluate the potential of recombinant proteins T. pallidum Тр0163 and Тр0971 as candidate antigens for IgG determination in sera of syphilis patients using enzyme immunoassay.

Materials and methods: Recombinant T.pallidum proteins Тр0163 and Тр0971 were produced by Cusabio (China). Sera from patients with diagnosis of primary, secondary, early latent and late latent syphilis, and from healthy individuals, were used for the indirect ELISA. A positivity coefficient was determined as the ratio of the optical density obtained for each sample to the critical optical density. The positivity coefficient was used to determine the difference between groups of syphilis patients and healthy individuals using the Mann-Whitney test. The diagnostic efficiency of the ELISA was assessed in accordance with the standard for assessing diagnostic informativeness of laboratory tests.

Results: The overall diagnostic efficiency of recombinant proteins for IgG determination by enzyme immunoassay is 65,4% and 66,7% for Тр0163 and Тр0971 respectively, demonstrating specificity and positive predictive value of the study. The overall sensitivity of ELISA was not more than 68,8%.

Conclusions: In order to improve syphilis diagnostics, we believe it is important to continue working with these antigens to determine the effectiveness of ELISA detecting IgM/IgG antibodies with a large number of samples.

Keywords

Treponema pallidum, recombinant proteins, Tр0163, Tр0971, enzyme-linked immunosorbent assay

Full Text

Обоснование

Серологические методы занимают ведущее положение в лабораторной диагностике сифилитической инфекции. В последние годы платформой выбора при выполнении ферментных иммуноанализов в лабораториях стали трепонемные тесты с использованием рекомбинантных иммунодоминантных антигенов T. pallidum, таких как Tp15 (Tp0171), Tp17 (Tp0435) и Tp47 (Tp0574) и TmpA (Tp44,5, Tp0768). Метод иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием рекомбинантных антигенов широко применяется в диагностике всех форм сифилиса в силу высокой чувствительности и специфичности, а также возможности выявления заболевания при отсутствии клинических проявлений, что является актуальным для скрытой формы сифилиса. Преимуществами метода являются также автоматизированное выполнение и объективная интерпретация результатов, а его ограничениями - невозможность дифференцировать различные формы заболевания и низкая информативность при оценке эффективности проводимого лечения [1]. Поиск дополнительных чувствительных и специфических антигенов могут расширить возможности серологической диагностики сифилиса.

Основу для широкомасштабного обнаружения таких антигенов открыла разработка методов функциональной геномики и протеомики, и на их основе - технологии получения рекомбинантных белков. Детальное рассмотрение групп белков, проявляющих иммуногенные свойства в течение сифилитической инфекции, выполнено McGill М. А. et al. [2] и Brinkman M. B. et al. [3]. Опираясь на работы этих исследователей и собственные результаты биоинформатического анализа, в 2012 г. в ФГБУ «ГНЦДК» Минздрава России (ГНЦДК) была изучена перспектива диагностического использования ряда белков T. pallidum, иммуногенность которых в отношении человеческой сыворотки была подтверждена обеими протеомными платформами [4]. Были выбраны 6 протеинов, для которых в ГНЦДК de novo создали генетические экспрессионные системы. После очистки с помощью аффинной хроматографии полученные рекомбинантные белки были использованы в качестве антигенов для определения специфических IgG в сыворотках крови больных разными формами сифилиса методами иммуноферментного и иммунофлуоресцентного анализов [5-9]. Полученные данные характеризовали новые антигены как перспективные для диагностики сифилитической инфекции.

Поиск антигенов T. pallidum, которые могли бы служить маркерами стадии сифилиса, или подходить для мониторинга ответа на лечение, или быть использованы в качестве рекомбинантных вакцин продолжаются до сих пор [10 - 12].

В настоящей работе мы продолжили исследование кандидатных антигенов для диагностики сифилиса, отобранных в результате биоинформатического анализа двух протеомных платформ [4] и оценили перспективы применения рекомбинантных белков T. pallidum Тр0163 и Тр097 как антигенов при исследовании сывороток больных сифилисом методом иммуноферментного анализа.

Tp163 (TroA) - периплазматический белок в составе АТФ-связывающего транспортного комплекса. В работе Brinkman et al. [3] показано двухкратное превышение фоновых значений при исследовании антител к данному антигену в сыворотке крови больных ранним скрытым сифилисом, тогда как при манифестных формах значительного превышения не описано. При этом в скрининге McGill et al. [2] были получены значения серореактивности 3+ для образцов сыворотки больных первичного, вторичного, раннего и позднего скрытого сифилиса.

Tp0971 - периплазматический липопротеин, который, как полагают, прикреплен к внутренней мембране T. pallidum [13, 14]. В работе Brinkman et al. [3] показано 4-кратное превышение фоновых значений уровня антител к данному антигену в группе больных первичным сифилисом и 8-кратное в группе раннего скрытого сифилиса по сравнению с контрольными образцами здоровых индивидов. В скрининге McGill et al. [2] были получены значения серореактивности 1+ для образцов сыворотки больных с поздним скрытым сифилисом и 2+ - с первичным, вторичным, ранним скрытым сифилисом.

В более поздних работах были показаны индукция выработки высоких уровней специфических антител IgG у кроликов в ответ на введение рекомбинантного Tp0971 [11], а также реактивность сыворотки пациентов с первичным сифилисом к рекомбинантному Tp0163 [12].

Целью нашей работы стала оценка потенциала рекомбинантных белков T. pallidum Тр0163 и Тр0971 в качестве кандидатных антигенов для определения IgG в сыворотках больных первичным, ранним скрытым, поздним скрытым и вторичным сифилисом методом иммуноферментного анализа.

Материалы и методы

Рекомбинантные белки T. pallidum Тр0163 и Тр0971 произведены фирмой Cusabio (Китай).

Для исследования методом непрямого иммуноферментного анализа использовали образцы сывороток крови пациентов с подтвержденным диагнозом первичного (n=15), вторичного (n=8), раннего скрытого (n=16), позднего скрытого (n=19) сифилиса и от здоровых лиц (n=20) как группы контроля. Диагноз и классификация заболевания определялись в соответствии с Клиническими рекомендациями «Сифилис» (2020 г.) на основе объединения клинических признаков, симптомов, истории сексуальных контактов и лабораторных серологических тестов.

Непрямой иммуноферментный анализ IgG (ИФА)

Рекомбинантные антигены Тр0163 и Тр0971 по отдельности разводили в 0,05М карбонат - бикарбонатном буфере (рН 9,6) до концентрации 1 мкг/мл и добавляли в 96-луночные микропланшеты (ServiceBio) по 100 мкл на лунку, после чего инкубировали в течение ночи при комнатной температуре. Микропланшеты один раз промывали фосфатно-солевым буферным раствором, содержащим 0,05% твина 20 (ФСРт) и блокировали раствором 3% сухого обезжиренного молока (с 5 % сахарозы) в ФСРт по 150 мкл в лунку 1,5 часа при комнатной температуре в темноте. После удаления блокирующего буфера и высушивания в планшеты вносили по сто мкл исследуемых образцов сыворотки в разведении 1:100 (в ФСРт с 1% сухого обезжиренного молока) и инкубировали 30 мин при 37°C. Планшеты трижды промывали ФСРт для удаления несвязавшихся антител. По 100 мкл HRP-конъюгированные козьи антитела против IgG человека (Merck Millipore) добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 35 минут при 37°C. Для обнаружения иммунокомплексов планшеты проявляли добавлением в каждую лунку 100 мкл субстрата тетраметилбензидин-H₂O₂ на 15-20 мин с инкубацией при 37°С в темноте. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 0,2 М серной кислоты и измеряли поглощение (оптическую плотность) при 450 нм с использованием ИФА анализатора Multiskan FC (Thermo scientific). Результатом тестирования сыворотки установили коэффициент позитивности (КП), который определяли отношением оптической плотности (ОП) образца пациента с определённой формой сифилиса к критической оптической плотности (среднему значению ОП образцов здоровых индивидов). Позитивными считали значения, превышающие 4

КП использовали для определения различия между группами больных сифилисом и здоровых индивидов по критерию Манна-Уитни для непарных выборок. Критическое значение уровня статистической значимости принималось равным 0,05.

Анализ диагностической ценности рекомбинантных антигенов Тр0163 и Тр0971 T. pallidum проводили в соответствии с ГОСТ Р 53022.3—2008 «Требования к качеству клинических лабораторных исследований. Часть 3 [15]. Правила оценки клинической информативности лабораторных тестов», используя коэффициенты позитивности (КП) исследованных сывороток. Диагностические показатели вычисляли по формулам:

– чувствительность = ИП/(ИП +ЛО)*100% (1);

– специфичность = ИО/(ИО + ЛП)*100% (2);

– положительная предсказательная ценность = ИП/(ИП + ЛП)*100% (3);

– отрицательная предсказательная ценность = ИО/(ИО + ЛО)*100% (4);

– диагностическая эффективность = (ИП + ИО)/(ИП + ЛО + ИО + ЛП)*100% (5);

где ИП – истинно положительные результаты, ЛО – ложноотрицательные результаты,

ИО – истинно отрицательные результаты, ЛП – ложноположительные результаты.

Результаты

Предварительный анализ возможности диагностического использования рекомбинантных белков Тр0163 и Тр0971 T. pallidum для определения антител класса IgG методом ИФА проводили с 58 образцами сывороток крови четырёх групп больных следующими формами сифилиса: первичный сифилис (n=15), вторичный сифилис (n=8), ранний скрытый сифилис (n=16) и поздний скрытый сифилис (n=19). Контрольная группа состояла из 20 образцов сыворотки здоровых индивидов. Результаты ИФА с применением обоих антигенов представлены в таблице 1, а диагностические характеристики рекомбинантных антигенов Тр0163 и Тр0971 – в таблице 2.

Исследования показали, что результаты ИФА по определению антител класса IgG на основе Тр0163 и Тр0971 в целом соответствует клиническому диагнозу. Для обоих антигенов характерна значительная вариабельность иммунного ответа во всех исследованных группах больных сифилисом (таблица 1). В каждой из групп больных было получено некоторое количества ложноотрицательных результатов, в то время как в группе здоровых не отмечено ни одного ложноположительного результата.

Отличия значений КП между группой здоровых индивидов и группой больных вторичным сифилисом по отношению к обоим антигенам, определённые по критерию Манна-Уитни, оказались статистически не значимы. При этом средние значения КП в группе больных вторичным сифилисом были достаточно высокими и превышали КП в группе здоровых индивидов в 19,9 и в 11,41 раза по отношению к Тр0163 и Тр0971 соответственно. Кроме того, в этих группах минимальное во всей выборке количество ложноотрицательных результатов – всего один с Тр0163. Тем не менее, большой разброс значений при малой выборке нивелировал перечисленные отличия.

Для пациентов с диагнозами первичный, ранний скрытый и поздний скрытый сифилис значения КП статистически значимо превышают таковые для контрольной группы. Диагностическая чувствительность определения IgG при этом для первичного, раннего скрытого и позднего скрытого сифилиса составляет 40%, 62,5% и 31,6% с Тр0163 и 66,7%, 68,8% и 15,8% с Тр0971 соответственно.

Таблица 1. Значения коэффициентов позитивности у здоровых лиц и в группах больных и уровень статистической значимости различий между группами по критерию Манна-Уитни

Table 1. Values of positivity coefficients in healthy individuals and in groups of patients and the level of statistical significance of differences between groups by the Mann-Whitney test

Группы индивидов		Диапазон значений КП	Среднее значение КП	Р
Тр0163
1	Здоровые (n=20)	0,5 – 1,7	0,9
2	Первичный сифилис (n=15)	0,6 – 19,2	5,15	Р_1,2< 0,05
3	Вторичный сифилис (n=8)	2,7 – 27,7	19,96	Р_1,3> 0,05*
4	Ранний скрытый сифилис (n=16)	0,8 - 32	10,17	Р_1,4< 0,05
5	Поздний скрытый сифилис (n=19)	1,2 – 12,5	4,34	Р_1,5< 0,05
Тр0971
7	Здоровые (n=20)	0,3 – 1,8	1,18
8	Первичный сифилис (n=15)	1,7 – 19,9	6,54	Р_7,8< 0,05
9	Вторичный сифилис (n=8)	4,5 – 15,9	11,41	Р_7,9> 0,05*
10	Ранний скрытый сифилис (n=16)	0,9 – 19,3	7,62	Р_7,10< 0,05
11	Поздний скрытый сифилис (n=19)	0,7 – 8,4	2,38	Р_7,11< 0,05

Примечание: * - различия статистически незначимы

Note: * - differences are statistically insignificant

Таблица 2. Диагностические параметры рекомбинантных белков Тр0163 и Тр0971 как антигенов для определения антител класса IgG при сифилисе методом ИФА

Table 2. Diagnostic parameters of recombinant proteins Tr0163 and Tr0971 as antigens for syphilis diagnosis by ELISA method

Диагностические характеристики	Тр0163	Тр0971
Общие (n=58)
Чувствительность (%)	53,4	66,7
Специфичность (%)	100	100
Положительная предсказательная ценность (%)	100	100
Отрицательная предсказательная ценность (%)	42,6	43,5
Диагностическая эффективность (%)	65,4	66,7
Чувствительность при определении
Первичного сифилиса (n=15) (%)	40	66,7
Вторичного сифилиса (n=8) (%)	87,5	100
Раннего скрытого сифилиса (n=16) (%)	62,5	68,8
Позднего скрытого сифилиса (n=19) (%)	31,6	15,8

Примечание: Параметры определялись в соответствии с ГОСТ Р 53022.3—2008

Note: Parameters were determined in accordance with GOST R 53022.3-2008

Общая диагностическая эффективность исследованных рекомбинантных белков для определения антител класса IgG отличается невысокими значениям – 65,4% и 66,7% для Тр0163 и Тр0971 соответственно, демонстрируя при этом высокую специфичность и положительную предсказательную ценность исследования (по 100%). Максимальную чувствительность оба антигена в нашем исследовании проявили в отношении вторичного сифилиса, но из-за малого размера выборки и значительного разброса значений КП результаты оказались статистически незначимыми. Чувствительность ИФА в отношении других форм сифилиса не превышает 68,8%.

Обсуждение

С выяснением генома T. pallidum и применением биоинформатического анализа многие рекомбинантные белки T. pallidum, такие как Tp15, Tp17, TmpA, Tp47, Tp0453, Tp0319, Tp1038, Tp0277, Tp0684, Tp0965 были оценены на предмет их диагностической ценности [5, 6, 8, 9, 12, 14]. Некоторые из них - Tp15, Tp17, TmpA, Tp47 используются в качестве диагностических антигенов в коммерческих тестах. Однако до сих пор диагностика сифилиса основывается на комбинации нескольких анализов, и не существует единого общепринятого серологического теста. Поэтому поиск чувствительных и специфичных антигенов для серологической диагностики сифилиса остаётся актуальным.

Белки Тр0163 и Тр0971 локализованы на цитоплазматической мембране T. pallidum со стороны периплазматического пространства, и, как показано в работах по изучению протеома T. pallidum [2, 3], обладают высокой иммуногенностью. Они же были отобраны в качестве кандидатных антигенов для диагностики сифилиса в результате биоинформатического анализа двух протеомных платформ [4]. Перспективность исследования их диагностических свойств была подтверждена работами Brinkman et al. [3] и McGill et al. [2], а позже - исследованиями Zhang X. et al. [11] и Haynes A. M. et al. [12].

Наше исследование подтверждает иммуногенность рекомбинантных белков Тр0163 и Тр0971. Оба антигена индуцируют достоверно значимое повышение специфических антител IgG в сыворотке крови больных ранним скрытым сифилисом. Специфичность и положительная предсказательная ценность исследования с обоими антигенами составили 100%. Мы считаем, что определённая в нашем эксперименте невысокая диагностическая эффективность обоих антигенов при определении антител класса IgG (65,4% и 66,7% для Тр0163 и Tp0971 соответственно) может быть повышена за счёт дополнительного определения антител класса IgМ или соотношения IgM/IgG антител, или же при их включении в состав смеси из нескольких антигенов T. pallidum.

Наше исследование имеет некоторые ограничения. Во-первых, небольшое количество клинических образцов сыворотки, особенно от пациентов с вторичным сифилисом. Во-вторых, не изучались образцы сыворотки пациентов с другими формами сифилиса.

Заключение

Рекомбинантные белки T. pallidum Тр0163 и Тр0971 сохраняют перспективность в качестве новых антигенов для серологической диагностики сифилиса. Дальнейшие исследования должны охватить более широкий круг случаев сифилиса и определение потенциала Тр0163 и Тр0971 в сочетании с другими трепонемными антигенами как для диагностики сифилиса, так и для мониторинга эффективности лечения.