Evaluation of recombinant proteins  T. pallidum  Тр0163 and Тр0971 as antigens for the diagnosis of syphilis using enzyme immunoassay

Natalia V. Arbuzova; Арбузова Наталья Владимировна; Marina V. Shpilevaya; Шпилевая Марина Валентиновна; Georgii L. Katunin; Катунин Георгий Леонидович; Oleg E. Kuznetsov; Кузнецов Олег Евгеньевич; Nikita Yu. Nosov; Носов Никита Юрьевич; Viсtoria  S. Solomka; Соломка Виктория Сергеевна

doi:10.25208/vdv16813

Evaluation of recombinant proteins T. pallidum Тр0163 and Тр0971 as antigens for the diagnosis of syphilis using enzyme immunoassay

Authors: Arbuzova N.V.¹, Shpilevaya M.V.¹, Katunin G.L.¹, Kuznetsov O.E.¹, Nosov N.Y.¹, Solomka V.S.¹
Affiliations:
1. State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology
Issue: Vol 100, No 6 (2024)
Pages: 53-60
Section: ORIGINAL STUDIES
Submitted: 01.08.2024
Accepted: 20.11.2024
Published: 15.12.2024
URL: https://vestnikdv.ru/jour/article/view/16813
DOI: https://doi.org/10.25208/vdv16813
ID: 16813

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Background. With the deciphering of the T. pallidum genome and the application of bioinformatics and immunoproteomics, many recombinant T. pallidum proteins have emerged that have been evaluated for their diagnostic value, some of which are used as diagnostic antigens in commercial tests. In practice, however, there are often significant difficulties in diagnosing asymptomatic forms of syphilis, especially late forms, when the sensitivity of serologic methods may vary considerably. Therefore, the search for more sensitive and specific antigens for the serological diagnosis of syphilis continues.

Aims. To evaluate the potential of recombinant proteins T. pallidum Тр0163 and Тр0971 as candidate antigens for the determination of IgG in the sera of syphilis patients using enzyme immunoassay.

Methods. Recombinant T. pallidum proteins Тр0163 and Тр0971 were produced by Cusabio (China). Serum samples from patients with a confirmed diagnosis of primary, secondary, early latent and late latent syphilis, as well as serum samples from healthy individuals as controls, were used for the indirect enzyme-linked immunosorbent assay. To characterize the antibody concentration, a positivity coefficient was determined as the ratio of the optical density obtained for each sample to the critical optical density. The positivity coefficient was used to determine the difference between groups of syphilis patients and healthy individuals using the Mann-Whitney test for unpaired samples, as well as to assess the clinical informativeness of the laboratory test. The diagnostic efficiency of the enzyme immunoassay was assessed by calculating the indices in the groups of patients with established syphilis diagnosis and in the group of healthy individuals, in accordance with the standard for assessing the diagnostic informativeness of laboratory tests.

Results. The overall diagnostic efficiency of the study of recombinant proteins for the determination of IgG class antibodies by enzyme immunoassay is 65.4 and 66.7% for Тр0163 and Тр0971 respectively, demonstrating the specificity and positive predictive value of the study. The sensitivity of ELISA in relation to the study of forms of syphilis was not 68.8%.

Conclusions. In order to improve the treponema-specific diagnosis of syphilis, we believe it is important to continue working with these antigens to determine the effectiveness of ELISA to detect IgG, IgM or IgM/ IgG antibodies with a large number of clinical serum samples from syphilis patients, patients with non-syphilitic pathology and healthy individuals.

Keywords

Treponema pallidum, recombinant proteins, Tр0163, Tр0971, enzyme-linked immunosorbent assay

Full Text

Обоснование

Серологические методы занимают ведущее положение в лабораторной диагностике сифилитической инфекции. В последние годы платформой выбора при выполнении ферментных иммуноанализов в лабораториях стали трепонемные тесты с использованием рекомбинантных иммунодоминантных антигенов T. pallidum, таких как Tp15 (Tp0171), Tp17 (Tp0435) и Tp47 (Tp0574) и TmpA (Tp44,5, Tp0768). Метод иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием рекомбинантных антигенов широко применяется в диагностике всех форм сифилиса в силу высокой чувствительности и специфичности, а также возможности выявления заболевания при отсутствии клинических проявлений, что актуально для скрытой формы сифилиса. Преимуществами метода являются также автоматизированное выполнение и объективная интерпретация результатов, а его ограничениями — невозможность дифференцировать различные формы заболевания и низкая информативность при оценке эффективности проводимого лечения [1]. Поиск дополнительных чувствительных и специфических антигенов может расширить возможности серологической диагностики сифилиса.

Возможность для широкомасштабного обнаружения таких антигенов открыла разработка методов функциональной геномики и протеомики и на их основе — технологии получения рекомбинантных белков. Детальное рассмотрение групп белков, проявляющих иммуногенные свойства в течение сифилитической инфекции, выполнено М.А. McGill и соавт. [2] и M.B. Brinkman и соавт. [3]. Опираясь на работы этих исследователей и собственные результаты биоинформатического анализа, в 2012 г. в ФГБУ «ГНЦДК» Минздрава России (ГНЦДК) была изучена перспектива диагностического использования ряда белков T. pallidum, иммуногенность которых в отношении человеческой сыворотки была подтверждена обеими протеомными платформами [4]. Было выбрано шесть протеинов, для которых в ГНЦДК de novo создали генетические экспрессионные системы. После очистки с помощью аффинной хроматографии полученные рекомбинантные белки были использованы в качестве антигенов для определения специфических IgG в сыворотке крови больных разными формами сифилиса методами ИФА и иммунофлуоресцентного анализа [5–9]. Полученные данные характеризовали новые антигены как перспективные для диагностики сифилитической инфекции.

Поиск антигенов T. pallidum, которые могли бы служить маркерами стадии сифилиса, или подходить для мониторинга ответа на лечение, или использоваться в качестве рекомбинантных вакцин, идет до сих пор [10–12].

В настоящей работе мы продолжили исследование кандидатных антигенов для диагностики сифилиса, отобранных в результате биоинформатического анализа двух протеомных платформ [4], и оценили перспективы применения рекомбинантных белков T. pallidum Тр0163 и Tp0971 как антигенов при исследовании сыворотки больных сифилисом методом ИФА.

Tp0163 (TroA) — периплазматический белок в составе АТФ-связывающего транспортного комплекса. В работе М.В. Brinkman и соавт. показано двукратное превышение фоновых значений при исследовании антител к данному антигену в сыворотке крови больных ранним скрытым сифилисом, тогда как при манифестных формах значительного превышения не описано [3]. При этом в скрининге М.А. McGill и соавт. были получены значения серореактивности 3+ для образцов сыворотки больных первичным, вторичным, ранним и поздним скрытым сифилисом [2].

Tp0971 — периплазматический липопротеин, который, как полагают, прикреплен к внутренней мембране T. pallidum [13, 14]. В работе М.В. Brinkman и соавт. показано 4-кратное превышение фоновых значений уровня антител к данному антигену в группе больных первичным сифилисом и 8-кратное в группе раннего скрытого сифилиса по сравнению с контрольными образцами здоровых индивидов [3]. В скрининге М.А. McGill и соавт. получены значения серореактивности 1+ для образцов сыворотки больных с поздним скрытым сифилисом и 2+ — с первичным, вторичным, ранним скрытым сифилисом [2].

В более поздних работах были показаны индукция выработки высоких уровней специфических антител IgG у кроликов в ответ на введение рекомбинантного Tp0971 [11], а также реактивность сыворотки пациентов с первичным сифилисом к рекомбинантному Tp0163 [12].

Цель исследования — оценка потенциала рекомбинантных белков T. pallidum Тр0163 и Тр0971 в качестве кандидатных антигенов для определения IgG в сыворотке больных первичным, ранним скрытым, поздним скрытым и вторичным сифилисом методом ИФА.

Методы

Дизайн исследования

Проведено пилотное, неконтролируемое, основанное на наблюдении исследование с контрольной группой образцов сыворотки крови здоровых доноров (n = 20) и 58 образцами сыворотки крови пациентов с подтвержденным диагнозом сифилиса следующих форм: первичный (n = 15), вторичный (n = 8), ранний скрытый (n = 16) и поздний скрытый (n = 19).

Критерии соответствия

Критерии включения: пациенты обоего пола от 18 лет с диагнозом первичного, вторичного, раннего скрытого и позднего скрытого сифилиса. Группа контроля состояла из практически здоровых лиц обоего пола от 18 лет.

Критерии исключения: беременность, сифилис других форм.

Условия проведения

Диагноз определялся врачом-дерматовенерологом ГНЦДК в соответствии с клиническими рекомендациями «Сифилис» (2020 г.) на основании данных анамнеза, клинических признаков и результатов серологических тестов. Взятие крови проводилось в клинической лаборатории ГНЦДК, серологические исследования (ИФА) — в этом же учреждении в отделе лабораторной диагностики инфекций, передаваемых половым путем, и дерматозов.

Исследовали сыворотки крови, полученные от пациентов центрального региона Российской Федерации, обратившихся в ГНЦДК в период с сентября 2023 по май 2024 г.

Описание исследования

Использовался непрямой ИФА IgG. Рекомбинантные белки T. pallidum Тр0163 и Тр0971 произведены фирмой Cusabio (Китай).

Рекомбинантные антигены Тр0163 и Тр0971 по отдельности разводили в 0,05 М карбонат-бикарбонатном буфере (рН 9,6) до концентрации 1 мкг/мл и добавляли в 96-луночные микропланшеты (ServiceBio) по 100 мкл на лунку, после чего инкубировали в течение ночи при комнатной температуре. Микропланшеты 1 раз промывали фосфатно-солевым буферным раствором, содержащим 0,05% твина 20 (ФСРт), и блокировали раствором 3% сухого обезжиренного молока (с 5% сахарозы) в ФСРт по 150 мкл в лунку 1,5 ч при комнатной температуре.

После удаления блокирующего буфера и высушивания в планшеты вносили по 100 мкл исследуемых образцов сыворотки в разведении 1:100 (в ФСРт с 1% сухого обезжиренного молока) и инкубировали 30 мин при 37 °C. Планшеты трижды промывали ФСРт для удаления несвязавшихся антител. По 100 мкл HRP-конъюгированные козьи антитела против IgG человека (Merck Millipore) добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 35 мин при 37 °C. Для обнаружения иммунокомплексов планшеты проявляли добавлением в каждую лунку 100 мкл субстрата тетраметилбензидин-H₂O₂ на 15–20 мин с инкубацией при 37 °С в темноте. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 0,2 М серной кислоты.

Методы регистрации исходов

Оптическую плотность (ОП) продуктов иммуноферментной реакции в лунках планшета измеряли при 450 нм с использованием ИФА-анализатора Multiskan FC (Thermo Scientific, США). Для интерпретации результатов определяли пороговый уровень ОП (ОП_пор) как среднее значение ОП образцов сыворотки крови здоровых индивидов.

ОП_пор использовали для определения коэффициента позитивности (КП):

КП = ОП_{образца}/ ОП_пор,

где ОП_{образца} — ОП любого исследуемого образца сыворотки.

В дальнейшем «положительными» считали значения КП, превышающие 4, рекомендованное для нашей тест-системы.

Статистический анализ

Количественные характеристики КП проверяли на нормальность распределения по критериям Колмогорова–Смирнова и Шапиро–Уилка. Различия между группами оценивали по критерию Фишера для однофакторного дисперсионного анализа. При попарном сравнении средних значений использовали критерий Стьюдента для независимых групп. Критерий уровня значимости соответствовал p < 0,05.

Образцы сыворотки крови пациентов с подтвержденным диагнозом «сифилис», классифицированные в ИФА как положительные, обозначали как истинно положительные (ИП); классифицированные в ИФА как отрицательные — как ложно отрицательные (ЛО); классифицированные в ИФА как положительные — как ложно положительные (ЛП); образцы сыворотки крови здоровых доноров, классифицированные в ИФА как отрицательные, классифицировали как истинно отрицательные (ИО).

Анализ диагностической ценности рекомбинантных антигенов Тр0163 и Тр0971 T. pallidum проводили в соответствии с ГОСТ Р 53022.3-2008 «Технологии лабораторные клинические. Требования к качеству клинических лабораторных исследований. Часть 3. Правила оценки клинической информативности лабораторных тестов» [15] с использованием КП исследованных сывороток.

Диагностические показатели вычисляли по следующим формулам:

Чувствительность = ИП / (ИП + ЛО) × 100%, (1)

Специфичность = ИО / (ИО + ЛП) × 100%, (2)

Положительная предсказательная ценность = ИП / (ИП + ЛП) × 100%, (3)

Отрицательная предсказательная ценность = ИО / (ИО + ЛО) × 100%, (4)

Диагностическая эффективность = (ИП + ИО) / (ИП + ЛО + ИО + ЛП) × 100%, (5)

где ИП, ИО — соответственно истинно положительные и истинно отрицательные результаты; ЛО, ЛП — соответственно ложноотрицательные и ложноположительные результаты.

Этическая экспертиза

Проведение исследования одобрено независимым локальным этическим комитетом Федерального государственного бюджетного учреждения «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии» (протокол № 2 от 28 февраля 2023 г.). Биологический материал для исследования получен от пациентов в соответствии с письменным информированным добровольным согласием.

Результаты

Предварительный анализ возможности диагностического использования рекомбинантных белков Тр0163 и Тр0971 T. pallidum для определения антител класса IgG методом ИФА проводили с 58 образцами сывороток крови четырех групп больных следующими формами сифилиса: первичный сифилис (n = 15), вторичный сифилис (n = 8), ранний скрытый сифилис (n = 16) и поздний скрытый сифилис (n = 19). Контрольная группа состояла из 20 образцов сыворотки здоровых индивидов. Результаты ИФА с применением обоих антигенов представлены в табл. 1, а диагностические характеристики рекомбинантных антигенов Тр0163 и Тр0971 — в табл. 2.

Таблица 1. Значения коэффициентов позитивности у здоровых лиц и в группах больных и уровень статистической значимости различий между группами по критерию Манна–Уитни

Table 1. Values of positivity coefficients in healthy individuals and in groups of patients and the level of statistical significance of differences between groups by the Mann–Whitney test

Группа индивидов	Диапазон значений	Среднее значение	р
*Тр0163*
Здоровые (n = 20)	0,5–1,7	0,90
Первичный сифилис (n = 15)	0,6–19,2	5,15	р_1,2< 0,05
Вторичный сифилис (n = 8)	2,7–27,7	19,96	р_1,3> 0,05*
Ранний скрытый сифилис (n = 16)	0,8–32,0	10,17	р_1,4< 0,05
Поздний скрытый сифилис (n = 19)	1,2–12,5	4,34	р_1,5< 0,05
*Тр0971*
Здоровые (n = 20)	0,3–1,8	1,18
Первичный сифилис (n = 15)	1,7–19,9	6,54	р_7,8< 0,05
Вторичный сифилис (n = 8)	4,5–15,9	11,41	р_7,9> 0,05*
Ранний скрытый сифилис (n = 16)	0,9–19,3	7,62	р_7,10< 0,05
Поздний скрытый сифилис (n = 19)	0,7–8,4	2,38	р_7,11< 0,05

Примечание. * — различия статистически незначимы.

Note. * — differences are statistically insignificant.

Таблица 2. Диагностические параметры рекомбинантных белков Тр0163 и Тр0971 как антигенов для определения антител класса IgG при сифилисе методом иммуноферментного анализа

Table 2. Diagnostic parameters of recombinant proteins Tr0163 and Tr0971 as antigens for syphilis diagnosis by the method of enzyme immunoassay

Диагностические характеристики	Тр0163	Тр0971
Общие (n = 58), %:
Чувствительность	53,4	66,7
Специфичность	100,0	100,0
Положительная предсказательная ценность	100,0	100,0
Отрицательная предсказательная ценность	42,6	43,5
Диагностическая эффективность	65,4	66,7
Чувствительность (%) при определении:
первичного сифилиса (n = 15)	40,0	66,7
вторичного сифилиса (n = 8)	87,5	100,0
раннего скрытого сифилиса (n = 16)	62,5	68,8
позднего скрытого сифилиса (n = 19)	31,6	15,8

Примечание. Параметры определялись в соответствии с ГОСТ Р 53022.3-2008.

Note. Parameters were determined in accordance with GOST R 53022.3-2008.

Исследования показали, что результаты ИФА по определению антител класса IgG на основе Тр0163 и Тр0971 в целом соответствуют клиническому диагнозу. Для обоих антигенов характерна значительная вариабельность иммунного ответа во всех исследованных группах больных сифилисом (см. табл. 1). В каждой группе больных было получено некоторое количество ложноотрицательных результатов, в то время как в группе здоровых не отмечено ни одного ложноположительного результата.

Отличия значений КП между группами здоровых индивидов и больных вторичным сифилисом по отношению к обоим антигенам оказались статистически незначимы. При этом средние значения КП в группе больных вторичным сифилисом были достаточно высокими и превышали КП в группе здоровых индивидов в 19,90 и 11,41 раза по отношению к Тр0163 и Тр0971 соответственно. Кроме того, в этих группах фиксировалось минимальное во всей выборке количество ложноотрицательных результатов — всего один с Тр0163. Тем не менее большой разброс значений при малой выборке нивелировал перечисленные отличия.

Для пациентов с диагнозами первичного, раннего скрытого и позднего скрытого сифилиса значения КП статистически значимо превышают таковые для контрольной группы. Диагностическая чувствительность определения IgG при этом для первичного, раннего скрытого и позднего скрытого сифилиса составляет соответственно 40; 62,5; 31,6% с Тр0163 и 66,7; 68,8; 15,8% с Тр0971.

Общая диагностическая эффективность исследованных рекомбинантных белков для определения антител класса IgG отличается невысокими значениями — 65,4 и 66,7% соответственно для Тр0163 и Тр0971, демонстрируя при этом высокую специфичность и положительную предсказательную ценность исследования (по 100%). Максимальную чувствительность оба антигена в нашем исследовании проявили в отношении вторичного сифилиса, но из-за малого размера выборки и значительного разброса значений КП результаты оказались статистически незначимыми. Чувствительность ИФА в отношении других форм сифилиса не превышает 68,8%.

Обсуждение

С выяснением генома T. pallidum и применением биоинформатического анализа многие рекомбинантные белки T. pallidum, такие как Tp15, Tp17, TmpA, Tp47, Tp0453, Tp0319, Tp1038, Tp0277, Tp0684, Tp0965, были оценены на предмет их диагностической ценности [5, 6, 8, 9, 12, 14]. Некоторые из них — Tp15, Tp17, TmpA, Tp47 — используются в качестве диагностических антигенов в коммерческих тестах. Однако до сих пор диагностика сифилиса основывается на комбинации нескольких анализов, и единого общепринятого серологического теста не существует. Поэтому поиск чувствительных и специфичных антигенов для серологической диагностики сифилиса остается актуальной задачей.

Белки Тр0163 и Тр0971 локализованы на цитоплазматической мембране T. pallidum со стороны периплазматического пространства и, как показано в работах по изучению протеома T. pallidum [2, 3], обладают высокой иммуногенностью. Они же были отобраны в качестве кандидатных антигенов для диагностики сифилиса в результате биоинформатического анализа двух протеомных платформ [4]. Перспективность исследования их диагностических свойств была подтверждена работами M.B. Brinkman и соавт. [3] и М.А. McGill и соавт. [2], а позже — исследованиями X. Zhang и соавт. [11] и A.M. Haynes и соавт. [12].

Наше исследование подтверждает иммуногенность рекомбинантных белков Тр0163 и Тр0971. Оба антигена индуцируют достоверно значимое повышение специфических антител IgG в сыворотке крови больных ранним скрытым сифилисом. Специфичность и положительная предсказательная ценность исследования с обоими антигенами составили 100%. Показано, что диагностическая эффективность ИФА при сифилисе варьируется в зависимости как от антигенов, используемых для обнаружения антител к T. pallidum [16], так и от стадии инфекции [17, 18]. Кроме того, ИФА на основе изолированных рекомбинантных антигенов менее чувствителен, чем при использовании антигенных наборов [19, 20]. Умеренная диагностическая эффективность, наблюдаемая в нашем эксперименте для Тр0163 и Тр0971 при определении антител класса IgG (65,4 и 66,7% соответственно для Тр0163 и Tp0971), предполагает, что каждый белок сам по себе может не быть эффективным кандидатом для диагностики, но мы считаем, что установленная в нашем эксперименте результативность тестирования может быть повышена за счет дополнительного определения антител класса IgМ, или соотношения антител IgM/IgG , или включения исследуемых белков в состав наборов из нескольких антигенов T. pallidum.

Исследование предусматривает дальнейшее изучение диагностической ценности рекомбинантных белков Тр0163 и Тр0971 отдельно или в составе наборов с другими антигенами T. pallidum с большим количеством образцов сыворотки крови больных различными формами сифилиса, а также вероятностной дифференциации скрытых форм сифилиса с ложноположительными реакциями на сифилис. Кроме того, планируется изучение динамики профиля антител класса IgG или соотношения IgM/IgG в сыворотке крови больных сифилисом, в частности поздним скрытым, до и после специфической терапии с целью оценки возможности использования данных антигенов для разработки серологических критериев эффективности терапии.

Поиск антител T. pallidum, специфичных для определенных стадий сифилиса или характеризующихся альтернативным характером экспрессии при различных формах заболевания, в последние десятилетия активно развивается, что связано с расширением протеомных платформ [10–12] и возможностями получения рекомбинантных аналогов труднодоступных белков трепонемы. Полученные к настоящему времени результаты немногочисленны и противоречивы [16, 19, 21–25], в том числе в отношении, казалось бы, хорошо изученных антигенов Tp15 (Tp0171), Tp17 (Tp0435) и Tp47 (Tp0574) и TmpA (Tp44,5, Tp0768) [19, 22]. Результаты таких исследований носят предварительный характер и помогают увидеть перспективность дальнейшей работы с теми или иными антигенами, а также улучшить понимание развития иммунного ответа при сифилисе.

Заключение

Рекомбинантные белки T. pallidum Тр0163 и Тр0971 сохраняют перспективность в качестве новых антигенов для серологической диагностики сифилиса. Дальнейшие исследования должны охватить более широкий круг случаев сифилиса и определение потенциала Тр0163 и Тр0971 в сочетании с другими трепонемными антигенами как для диагностики сифилиса, так и для мониторинга эффективности специфического лечения.

About the authors