Microarray technologies for analysis of genetic determinants of Neisseria gonorrhoeae antimicrobial resistance

Full Text

Обоснование

Несмотря на почти 100-летнюю историю терапии гонококковой инфекции разнообразными противомикробными препаратами, в мире ежегодно регистрируют более 80 млн случаев данного заболевания [1]. Возбудителем гонореи является грамотрицательная бактерия Neisseria gonorrhoeae, обладающая исключительной способностью формировать устойчивость к антибиотикам [2]. Доля лекарственно-устойчивых штаммов N. gonorrhoeae в мире повышается с каждым годом; регулярно публикуются случаи неудачной терапии гонококковой инфекции рекомендованными препаратами, обусловленной суперустойчивыми вариантами гонококка [2–4]. Эпидемиологические данные свидетельствуют, что ситуация с гонококковой инфекцией в России на протяжении двух десятилетий XXI в. была и остается лучше, чем в странах Европы и США, несмотря на общий рост заболеваемости в последнее время: в 2021 г. — повышение на 10,4% в сравнении с предыдущим годом; в 2022 г. — на 10,0%; за первые четыре месяца 2023 г. — на 5,5% относительно аналогичного периода 2022 г. [5].

Препаратом выбора для лечения гонококковой инфекции в Российской Федерации является цефалоспорин III поколения цефтриаксон. В российской популяции гонококка доля изолятов, устойчивых к цефтриаксону, минимальна, в работах сообщается об обнаружении только чувствительных изолятов [6]. Такое состояние нетипично на фоне общемировой тенденции роста случаев выявления устойчивых к цефалоспоринам III поколения изолятов [7–11]. Весьма непростая ситуация наблюдается в Китае, где доля устойчивых к цефтриаксону изолятов увеличилась c 2,9% в 2017 г. до 8,1% в 2022 г. [7].

Анализ чувствительности российской популяции N. gonorrhoeae к азитромицину (используемому как компонент комбинированной терапии для лечения гонококковой инфекции в большом числе стран, но не рекомендованному для терапии в России) зафиксировал рост устойчивых изолятов с 0% в 2018–2019 гг. до 17% в 2020 г. и 9% в 2021 г. [12]. Такая доля устойчивых к азитромицину изолятов исключает его применение в соответствии с критерием Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), при котором общая доля чувствительных штаммов гонококка в отношении противомикробного препарата не должна быть ниже 95% [13]. Вместе с тем полученные данные об устойчивости N. gonorrhoeae к азитромицину подчеркивают необходимость дальнейшего эпидемиологического наблюдения за распространением новых вариантов возбудителя гонококковой инфекции в России.

В сложившейся ситуации весьма актуальны исследования, направленные на ежегодный мониторинг российской популяции возбудителя гонококковой инфекции, включающий идентификацию генетических детерминант устойчивости как к цефтриаксону, так и к азитромицину, а также к препаратам, применявшимся для терапии гонореи ранее, — пенициллину, тетрациклину и ципрофлоксацину. Для решения поставленных задач ИМБ РАН совместно с Государственным научным центром дерматовенерологии и косметологии Минздрава России (ФГБУ «ГНЦДК» Минздрава России) разработано несколько поколений олигонуклеотидных гидрогелевых микрочипов (биочипов), обеспечивающих точную идентификацию генетических детерминант устойчивости N. gonorrhoeae к различным противомикробным препаратам [12, 14, 15]. Особое внимание уделено анализу устойчивости к цефтриаксону, где по результатам идентификации детерминант на биочипе применяется метод машинного обучения для предсказания минимальной подавляющей концентрации (МПК) цефтриаксона [16]. Созданный подход с описанными в настоящей работе модификациями в виде молекулярных зондов для установления принадлежности к виду N. gonorrhoeae стал основой набора реагентов «NG-ТЕСТ» для идентификации генетических детерминант устойчивости возбудителя гонококковой инфекции N. gonorrhoeae к цефалоспоринам III поколения.

Цель настоящего исследования — актуализация данных о распространении генетических детерминант устойчивости изолятов современной (2019–2023 гг.) российской популяции N. gonorrhoeae к ряду противомикробных препаратов с использованием технологии гидрогелевых биочипов.

Методы Объекты исследования

В исследование включено 360 клинических изолятов N. gonorrhoeae, поступивших в референс-центр ФГБУ «ГНЦДК» Минздрава России в рамках проведения мониторинга устойчивости к противомикробным препаратам возбудителей инфекций, передаваемых половым путем, в том числе в 2019 г. — 123 клинических изолята; в 2020 г. — 119; в 2021 г. — 52; в 2022 г. — 25; в 2023 г. — 42. Образцы поступали из специализированных медицинских учреждений дерматовенерологического профиля, расположенных в восьми субъектах Российской Федерации, относящихся к пяти федеральным округам: Центральному — г. Москва (n = 17) и Калужская область (n = 101); Северо-Западному — Архангельская область (n = 29); Южному — Астраханская область (n = 23); Приволжскому — Республика Татарстан (n = 20) и Республика Чувашия (n = 76); Сибирскому — Омская (n = 20) и Новосибирская (n = 74) области.

Первичную идентификацию изолятов N. gonorrhoeae проводили в регионе их выделения по результатам микроскопического исследования и оксидазного теста [17–19]. Окончательную верификацию осуществляли в референс-центре ФГБУ «ГНЦДК» Минздрава России с использованием NH-карт на анализаторе VITEK 2 Compact (bioMérieux, Франция). В отношении грам-отрицательных оксидазо-положительных диплококков по совокупности биохимических свойств, оцененных как N. gonorrhoeae с вероятностью менее 99%, проводили дополнительное подтверждающее исследование с использованием времяпролетного масс-спектрометра с ионизацией MALDI Microflex (Bruker Daltonics GmbH, Германия).

Тестирование чувствительности к противомикробным препаратам

Определение чувствительности штаммов N. gonorrhoeae к противомикробным препаратам проводили методом серийных разведений в агаре в соответствии со стандартной процедурой [20] с использованием контрольного штамма N. gonorrhoeae АТСС 49226 из коллекции типовых культур микроорганизмов. Оценку чувствительности N. gonorrhoeae к противомикробным препаратам выполняли в соответствии с критериями МУК 4.2.1890-04 (https://fcgie.ru/download/elektronnaya_baza_metod_dokum/muk_1890-04.pdf, дата обращения: 12.09.2024) для всех противомикробных препаратов, кроме азитромицина, для которого применяли критерии EUCAST (The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, Version 14.0, http://www.eucast.org, дата обращения: 12.09.2024). Критерии чувствительности N. gonorrhoeae к противомикробным препаратам приведены в табл. 1.

 

Таблица 1. Критерии фенотипической чувствительности N. gonorrhoeae к противомикробным препаратам

Table 1. AMR criteria of N. gonorrhoeae

Противомикробный препарат (Ч; УР; Р, мг/л)

Пенициллин (≤ 0,06; 0,12–1,0; ≥ 2,0)

Цефтриаксон (≤ 0,25; — ; > 0,25)

Тетрациклин (≤ 0,25; 0,5–1,0; ≥ 2,0)

Азитромицин (≤ 1,0; — ; > 1,0)

Ципрофлоксацин (≤ 0,03; 0,06; > 0,06)

Примечание. Ч — чувствительный; УР — умеренно резистентный; Р — резистентный. Азитромицин всегда используется в сочетании с другим эффективным средством (цефтриаксоном или цефиксимом). В МУК 4.2.1890-04 отсутствуют указания об азитромицине, в связи с чем использовали EUCAST 14.0, в котором порог устойчивости ECOFF составляет 1 мг/л.

Note. Ч — susceptible; УР — moderately resistant; Р — resistant. Azithromycin is routinely administered in combination with a second effective antimicrobial agent (e.g., cephalosporin or cefixime). MUK 4.2.1890-04 does not contain any indications for azithromycin, therefore EUCAST 14.0 was used, in which the ECOFF resistance threshold is 1 mg/l.

 

Идентификация генетических детерминант устойчивости N. gonorrhoeae к противомикробным препаратам

Выделение бактериальной ДНК выполняли с использованием набора «ДНК-Экспресс» («Литех», Россия), оценку концентрации ДНК — с помощью спектрофлюориметра Qubit 3.0 (Invitrogen, США).

Анализ генетических детерминант, ассоциированных с устойчивостью к цефтриаксону, проводили с использованием серийных образцов набора реагентов «NG-ТЕСТ». Специализированный гидрогелевый биочип (рис. 1) обеспечивал одновременное выявление следующих детерминант:

• инсерция кодона аспаргиновой кислоты в положение 345–346 гена penA и замены Ala311Val; Ile312Met; Val316Thr, Pro; Thr483Ser; Ala501Val, Thr, Pro; Asn512Tyr; Gly542Ser; Gly545Ser и Pro551Leu, Ser в мозаичных и немозаичных аллелях гена penA;
• замена Leu421Pro в гене ponA;
• замены Gly120Lys, Arg, Asp, Asn, Thr и Ala121Asp, Asn, Gly, Val, Ser в гене porB.

Биочип также включал молекулярные зонды для определения видоспецифичного для N. gonorrhoeae полиморфизма в мобильном элементе ISNgo2 (см. рис. 1).

 

Рис. 1. Схема биочипа, входящего в набор «NG-ТЕСТ» и содержащего 113 иммобилизованных олигонуклеотидных зондов

Fig. 1. Schematic representation of the microarray integrated into the NG-TEST kit, featuring 113 immobilized oligonucleotide probes for targeted genetic analysis

 

Элементы биочипа представлены в виде кружков, выделенных разными цветами исходя из анализируемого локуса, внутри них указан выявляемый маркер. Элементы с последовательностями зондов, соответствующих дикому типу, обведены толстым контуром. Элементы с индексами «Ng+» и «Ng–» содержат зонды к полиморфным локусам из мобильного элемента ISNgo2 и служат для видовой идентификации N. gonorrhoeae. Ячейки с индексом «0» не содержат олигонуклеотидов и используются для нормировки фонового сигнала. Ячейки с индексом «М» содержат флуоресцентный маркер и необходимы для автоматической обработки гибридизационной картины биочипа.

Процедура анализа включала мультиплексную амп-лификацию и одновременное флуоресцентное маркирование фрагментов генома N. gonorrhoeae с последующей гибридизацией полученных продуктов на биочипе, автоматизированной регистрацией и интерпретацией результатов с использованием универсального аппаратно-программного комплекса для анализа биочипов (ИМБ РАН, Россия). По результатам анализа определяли генетические детерминанты, ассоциированные с устойчивостью N. gonorrhoeae к противомикробным препаратам.

 

Рис. 2. Флуоресцентные гибридизационные картины и интерпретация результатов анализа изолятов N. gonorrhoeae на биочипе с использованием набора реагентов «NG-ТЕСТ»

Fig. 2. Fluorescent hybridization patterns and interpretation of genetic profiling results for antimicrobial resistance determinants in N. gonorrhoeae isolates analyzed using the NG-TEST kit

 

Значение МПК цефтриаксона индивидуального изолята с идентифицированным набором генетических детерминант вычисляли с помощью регрессионной модели с 20 параметрами, как описано ранее [16]. На рис. 2 представлены флуоресцентные картины и интерпретация результатов анализа на биочипах с целью идентификации мутаций и предсказания МПК цефтриаксона. Зеленым цветом отмечены элементы биочипа, в которых иммобилизованные зонды сформировали совершенные гибридизационные комплексы с ДНК дикого типа. Красным цветом выделены элементы биочипа с комплексами иммобилизованных молекулярных зондов и ДНК с мутациями (в соответствии со схемой биочипа на рис. 1). Отчеты об интерпретации результатов в виде подтверждения принадлежности анализируемой ДНК к виду N. gonorrhoeae, наличия/отсутствия мутаций в генах penA, ponA и porB и рассчитанных значений МПК цефтриаксона при анализе ДНК:

1) изолята без мутаций, несущего немозаичный ген penA (МПК цефтриаксона = 0,002 мг/л);

2) изолята, обладающего мозаичным геном penA с различными заменами и множественными мутациями в генах penA, porB, ponA (МПК цефтриксона = 0,031 мг/л). Оба изолята чувствительны к цефтриаксону в соответствии с критериями МУК 4.2.1890-04.

Определение генетических детерминант устойчивости изолятов N. gonorrhoeae к азитромицину, пенициллину, тетрациклину, ципрофлоксацину проводили, как описано ранее [12, 15]. В качестве маркеров устойчивости к азитромицину рассматривали присутствие замены C2611T в 23S рРНК или генетический профиль, в котором присутствует мозаичный аллель промотора mtrR совместно с мозаичным аллелем mtrD. Ранее была показана состоятельность данного подхода [21].

Статистический анализ

При анализе чувствительности изолятов к цефтриаксону и азитромицину сравнивали результаты определения устойчивости референсным микробиологическим и молекулярным методом и рассчитывали параметры диагностической специфичности ($S_p$) и чувствительности ($S_n$) при помощи следующих формул:

 

$\begin{array}{c}Sp = \raisebox{1ex}{$T_n$}\!\left/ \!\raisebox{-1ex}{$\left(T_n + F_p\right)$}\right. \times 100\%, \\ Sn = \raisebox{1ex}{$T_p$}\!\left/ \!\raisebox{-1ex}{$\left(T_p + F_n\right)$}\right. \times 100\%,\end{array}$

 

где $T_p$ и $T_n$ — соответственно истинно положительный и истинно отрицательный результаты; $F_p$ и $F_n$ — соответственно ложноположительный и ложноотрицательный результаты.

Результаты Устойчивость изолятов N. gonorrhoeae к цефтриаксону

Все проанализированные изоляты были чувствительны к цефтриаксону. 4,7% изолятов обладало значением МПК цефтриаксона, равным 0,06 мг/л, что ниже порога устойчивости только на два разведения. Распределение генетических детерминант устойчивости в популяции с учетом МПК цефтриаксона представлено на рис. 3.

 

Рис. 3. Распределение замен в генах penA, ponA и porB при разделении изолятов исследуемой выборки на группы со сниженной (МПК_цеф > 0,03 мг/л) и несниженной (МПК_цеф ≤ 0,03 мг/л) чувствительностью к цефтриаксону

Fig. 3. Distribution of amino acid substitutions in the penA, ponA, and porB genes in N. gonorrhoeae isolates stratified by ceftriaxone susceptibility: reduced (MIC_cef > 0.03 mg/L) vs. retained (MIC_cef ≤ 0.03 mg/L)

 

Значительная доля изолятов со сниженной чувствительностью (МПК_цеф > 0,03 мг/л) обладала заменами в генах penA (312Met,316Thr,501Val,545Ser,551Ser) и porB (120Lys). В большинстве случаев именно сочетания мутаций в генах penA, ponA и porB, а не единичные замены приводили к существенному снижению чувствительности к цефтриаксону. Изоляты со сниженной чувствительностью также характеризовались генетическими профилями, характерными для мозаичных аллелей penA, со следующими заменами: Ile312Met, Val316Thr, Asn512Tyr и Gly545Ser. Всего в исследуемой выборке мозаичные аллели гена penA обнаружены у 4,3% изолятов (см. рис. 3).

 

Таблица 2. Сравнение результатов определения значения МПК цефтриаксона у штаммов N. gonorrhoeae, полученных методом серийных разведений и с использованием набора «NG-ТЕСТ»

Table 2. Comparative analysis of ceftriaxone MIC determination in N. gonorrhoeae strains: agar dilution method versus the NG-TEST kit

Фенотипические данные		Предсказанная МПКцеф, мг/л
МПКцеф, мг/л	Число образцов	Среднее геометрическое
0,0015	1	0,005
0,002	114	0,0039
0,004	77	0,0077
0,008	76	0,0091
0,015	39	0,0135
0,03	36	0,009
0,06	17	0,0081

 

Результаты сравнения значений МПК цефтриаксона, полученных методом серийных разведений, с предсказанным набором «NG-ТЕСТ» значением МПК представлены в табл. 2. Как видно из данных таблицы, предсказанные значения МПК хорошо совпадают с экспериментально измеренными. Для 78% штаммов предсказанные значения отличались не более чем на одно двукратное разведение. При анализе выборки не было получено ложноположительных результатов, все изоляты были корректно определены как чувствительные. Таким образом, современная российская популяция гонококка продолжает оставаться чувствительной к цефтриаксону.

Устойчивость изолятов N. gonorrhoeae к азитромицину

Доля изолятов, устойчивых к азитромицину (МПК > 1 мг/л), составила суммарно 11% всей выборки. Распределение генетических профилей, ассоциированных с устойчивостью к азитромицину, при разделении изолятов на чувствительные и устойчивые представлено на рис. 4.

 

Рис. 4. Распределение генетических профилей локусов mtrR, mtrD и 23S рРНК в устойчивых и чувствительных к азитромицину изолятах в исследуемой выборке

Fig. 4. Distribution of resistance-associated genetic profiles in the mtrR, mtrD, and 23S rRNA loci among azithromycin-resistant versus azithromycin-susceptible N. gonorrhoeae isolates within the study sample

 

В изолятах, устойчивых к азитромицину, наблюдали увеличение доли генотипов с мозаичным промотором гена mtrR в сочетании с мозаичным геном mtrD. 7,5% устойчивых изолятов обладало заменами C2611T в 23S рРНК, причем во всех случаях они присутствовали во всех четырех копиях rrn-оперона. Не было выявлено ни одного изолята с заменами 2058G или 2059G в 23S рРНК. 2,5% изолятов, устойчивых к азитромицину, не содержало мутаций в анализируемых локусах mtrR, mtrD и 23S рРНК. Наиболее характерный для устойчивых к азитромицину изолятов генетический профиль включал мозаичный ген mtrD, мозаичный промотор mtrR и замену в кодирующей области гена mtrR Ala86Thr.

 

Таблица 3. Сравнение результатов определения чувствительности штаммов N. gonorrhoeae к цефтриаксону и азитромицину методом серийных разведений и с использованием микрочиповых технологий

Table 3. Comparative analysis of N. gonorrhoeae susceptibility to ceftriaxone and azithromycin: сoncordance between agar dilution assay and microarray-based technologies

Препарат	Характеристика устойчивости	Число изолятов с  соответствующим  фенотипом	Наличие детерминант устойчивости	Чувстви- тельность, %	Специ- фичность, %
Цефтриаксон	Чувствительные	360	0	—	100
	Устойчивые	0	0
Азитромицин	Чувствительные	339	24	88	93
	Устойчивые	21	18

 

По результатам сопоставления данных о фенотипической чувствительности к цефтриаксону и азитромицину и идентификации генетических детерминант устойчивости к указанным препаратам с использованием микрочиповых технологий определены диагностические характеристики молекулярных методов (табл. 3).

Устойчивость изолятов N. gonorrhoeae к ципрофлоксацину, тетрациклину и пенициллину

Устойчивость к ципрофлоксацину. В среднем доля изолятов, устойчивых к ципрофлоксацину (МПК ≥ 1 мг/л), составила 49%; 1% обладал промежуточной устойчивостью (МПК — 0,12–0,50 мг/л) и 50% было чувствительно (МПК ≤ 0,06 мг/л). Распределение генетических профилей, характеризующих устойчивость N. gonorrhoeae к ципрофлоксацину, при разделении выборки изолятов на чувствительные, промежуточно устойчивые и резистентные представлено на рис. 5.

 

Рис. 5. Распределение генетических профилей локусов gyrA и parC в устойчивых и чувствительных к ципрофлоксацину изолятах в исследуемой выборке

Fig. 5. Distribution of resistance-associated genetic profiles in the gyrA and parC loci among ciprofloxacin-resistant versus ciprofloxacin-susceptible N. gonorrhoeae isolates within the study sample

 

В большинстве устойчивых к ципрофлоксацину изолятов выявлялись мутации в «хинолоновом кармане», среди которых необходимо отметить замену Ser91Phe в гене gyrA. В исследуемой выборке она, как правило, не являлась единственной, а обнаруживалась в сочетании с заменами gyrA 95Ala/Gly/Asn и/ или parC 87Arg/91Gly, что приводило к резкому превышению МПК выше порога устойчивости (от 4 до 16 мг/л как для первого, так и для второго профиля соответственно).

Устойчивость к пенициллину. Доля изолятов, устойчивых к пенициллину (МПК ≥ 2 мг/л), составила 8%; 41% обладал промежуточной устойчивостью (МПК — 0,12–1,00 мг/л); 50% было чувствительно (МПК ≤ 0,06 мг/л). Распределение генетических профилей, характеризующих устойчивость N. gonorrhoeae к пенициллину, при разделении выборки изолятов на чувствительные, промежуточно устойчивые и резистентные представлено на рис. 6.

 

Рис. 6. Распределение генетических профилей локусов penA, ponA, porB и blaTEM в устойчивых и чувствительных к пенициллину изолятах в исследуемой выборке

Fig. 6. Distribution of resistance-associated genetic profiles in the penA, ponA, porB and blaTEM loci among penicillin-resistant versus penicillin-susceptible N. gonorrhoeae isolates within the study sample

 

31% устойчивых изолятов несли плазмиду blaTEM, наличие которой повышало МПК пенициллина до 4–32 мг/л. Замена в гене ponA Leu421Pro в сочетании с мутациями в генах penA и porB встречалась в 55% устойчивых изолятов. Существенная доля чувствительных изолятов обладала изолированной вставкой аспартата в кодоне 345 гена penA. Наиболее характерный для устойчивых к пенициллину изолятов генетический профиль включал замену в гене ponA Leu421Pro, вставку аспартата в кодоне 345 гена penA с заменой Gly542Ser в этом же гене и мутацию Gly120Lys в гене porB.

Устойчивость к тетрациклину. В среднем доля изолятов, устойчивых к тетрациклину (МПК ≥ 2 мг/л), составила 21%; 30% обладало промежуточной устойчивостью (МПК — 0,5–1,0 мг/л); 43% было чувствительно (МПК ≤ 0,25 мг/л). Распределение генетических профилей, характеризующих устойчивость N. gonorrhoeae к тетрациклину, при разделении выборки изолятов на чувствительные, промежуточно устойчивые и резистентные представлено на рис. 7.

 

Рис. 7. Распределение генетических профилей локусов rpsJ, mtrR, porB и tetM в устойчивых и чувствительных к тетрациклину изолятах в исследуемой выборке

Fig. 7. Distribution of resistance-associated genetic profiles in the rpsJ, mtrR, porB and tetM loci among tetracyclin-resistant versus tetracyclin-susceptible N. gonorrhoeae isolates within the study sample

 

62% изолятов, устойчивых к тетрациклину, несло конъюгативную плазмиду tetM, наличие которой повышало МПК тетрациклина до 4–16 мг/л. Изолированная мутация в кодирующей области гена mtrR Ala86Thr существенно чаще встречалась в чувствительных изолятах. Наиболее характерный для устойчивых к тетрациклину изолятов без конъюгативной плазмиды генетический профиль включал замену Val57Met в гене rpsJ, делецию аденина в положении -35 промотора гена mtrR и замену Ala86Thr в этом же гене, а также мутацию Gly120Lys в гене porB.

Динамика устойчивости изолятов N. gonorrhoeae к противомикробным препаратам в 2019–2023 гг.

Анализ распространения генетических профилей, характеризующих устойчивость N. gonorrhoeae к противомикробным препаратам, показывает различные тенденции в распространении характерных детерминант, вносящих наибольший вклад в повышение МПК. Доли изолятов с характерными генетическими детерминантами устойчивости к ципрофлоксацину, пенициллину, тетрациклину и азитромицину в 2019–2023 гг. представлены на рис. 8.

 

Рис. 8. Динамика встречаемости в 2019–2023 гг. изолятов N. gonorrhoeae, устойчивых к пенициллину, тетрациклину, ципрофлоксацину, азитромицину, обладающих генетическими детерминантами, вносящими наибольший вклад в повышение МПК. Линиями обозначено изменение долей характерных генетических детерминант. Столбцы гистограммы отражают ежегодную долю изолятов с фенотипической устойчивостью к соответствующему противомикробному препарату

Fig. 8. Temporal trends (2019–2023) in N. gonorrhoeae isolates resistant to penicillin, tetracycline, ciprofloxacin, and azithromycin, with genetic determinants driving elevated MICs. Bar plots illustrate the annual proportion of isolates exhibiting phenotypic resistance to each corresponding antimicrobial agent

 

Исчезновение изолятов, устойчивых к пенициллину, происходит на фоне ухода из популяции (по крайней мере в анализируемой выборке) штаммов с плазмидным геном blaTEM и снижения доли изолятов с хромосомными детерминантами устойчивости — заменой в гене ponA Leu421Pro и вставкой аспартата в кодоне 345 гена penA.

Обратная тенденция наблюдается при анализе устойчивости к тетрациклину: регистрируется рост доли изолятов с хромосомными детерминантами, локализованными в генах rpsJ, mtrR и porB. Особо следует отметить сохранение штаммов с плазмидным геном tetM — наиболее «мощной» детерминантой устойчивости к тетрациклину. В целом доля изолятов, устойчивых тетрациклину, остается на стабильно высоком уровне (~30%).

Ежегодное повышение доли устойчивых к ципро-флоксацину изолятов подтверждается соответствующими детерминантами в генах gyrA и parC, включающих в себя в том числе замену Ser91Phe в gyrA. Тенденции к снижению устойчивости N. gonorrhoeae к фторхинолонам в России в настоящее время не наблюдается.

В 2019 г. не было выявлено ни одного устойчивого к азитромицину изолята. Их появление датировано 2020 г. с закреплением в российской популяции гонококка штаммов, обладающих мозаичным промотором гена mtrR вместе с мозаичным геном mtrD. В то же время изоляты с мутациями в гене 23S рРНК остаются редкими: за рассматриваемый период было выявлено только три изолята с полиморфизмом C2611T.

Обсуждение

Результаты данного исследования показывают, что устойчивость гонококка к цефтриаксону в России соответствует критерию ВОЗ для применения антибиотика (доля чувствительных изолятов в популяции — более 95%). В то же время почти 5% выявленных изолятов со сниженной чувствительностью (МПК > 0,03 мг/л) к цефтриаксону и распространение устойчивых штаммов по всему миру в совокупности с применением цефтриаксона в качестве противомикробного препарата выбора обусловливают важность использования молекулярных методов для анализа устойчивости N. gonorrhoeae к данному препарату.

С 2020 г. зарегистрировано появление и закрепление в российской популяции гонококка изолятов, резистентных к азитромицину, ранее встречавшихся только спорадически [22]. Ввиду существенной доли таких изолятов, превышающей критерий ВОЗ, целесообразность применения данного препарата для терапии гонококковой инфекции в общем случае поставлена под сомнение.

В исследовании изолятов, полученных в России в 2005–2016 гг., была отмечена тенденция к снижению устойчивости к пенициллину, тетрациклину и ципро-флоксацину, связанная с исключением данных препаратов из схем терапии [22]. Результаты настоящей работы показывают, что такая тенденция сохраняется только для пенициллина. По-прежнему существует доля штаммов с промежуточной устойчивостью (или штаммов, устойчивых при повышенной экспозиции) при сокращении и элиминации изолятов с истинно резистентным к пенициллину фенотипом. Интересной особенностью популяции 2022–2023 гг. стала очень малая доля изолятов с плазмидным геном blaTEM при сохранении изолятов с плазмидами tetM. Ранее показано, что конъюгативная плазмида tetM у N. gonorrhoeae может способствовать переносу в клетку других плазмид, в том числе blaTEM [23], которые часто обнаруживаются совместно с плазмидами tetM [24]. Несмотря на прекращение использования ципрофлоксацина для терапии гонореи, наблюдается рост изолятов с множественными детерминантами устойчивости во «фторхинолоновом кармане» (в генах gyrA и parC) и сохранение стабильно высокой доли изолятов, устойчивых к ципрофлоксацину. В отсутствие селективного давления препарата эти мутации должны негативно воздействовать на бактериальный фитнес, однако данный процесс парадоксальным образом не сопровождается быстрой элиминацией соответствующих вариантов из популяции N. gonorrhoeae.

Разработанные микрочиповые технологии валидированы с использованием 360 клинических изолятов. Диагностическая специфичность набора реагентов «NG-ТЕСТ» составила 100%, при этом не было получено ни одного ложноотрицательного результата. Отличительной особенностью созданного метода является не просто разделение изолятов на чувствительные и устойчивые, но и определение значения МПК цефтриаксона для анализируемого образца. В настоящем исследовании метод показал хорошую сходимость с фенотипическим определением МПК для 78% изолятов. Помимо предсказания МПК, разработанный метод предоставляет данные о наличии генетических детерминант лекарственной устойчивости к цефалоспоринам, а значит, пригоден для решения задач как клинической лабораторной диагностики, так и молекулярной эпидемиологии гонококка.

При определении устойчивости к азитромицину с использованием биочипа получены значения диагностической чувствительности и специфичности 88% и 93%, соответственно. Эти характеристики сопоставимы с результатами, получаемыми при анализе данных полногеномного секвенирования азитромицин-устойчивых изолятов N. gonorrhoeae. Согласно данным базы Pathogenwatch, чувствительность и специфичность такого метода составляют 72% и 100%, соответственно [25].

Определенный интерес для молекулярной эпидемиологии также представляют описанные ранее биочипы [12, 14, 15], позволяющие получать данные о детерминантах устойчивости N. gonorrhoeae к применявшимся ранее ципрофлоксацину, пенициллину и тетрациклину. При анализе популяции гонококка показано, что для предсказания чувствительности изолята к противомикробным препаратам необходимо учитывать генетический профиль из мутаций в разных локусах, при этом вклад каждой мутации в фенотипическую чувствительность в общем случае различен. Использование микрочиповых технологий позволит в перспективе осуществлять динамическое наблюдение путей переноса N. gonorrhoeae в регионах, улучшить систему эпидемиологического наблюдения и повысить эффективность лечения гонореи.

Заключение

В российской популяции N. gonorrhoeae происходят активные процессы, связанные с перераспределением долей изолятов, устойчивых к разным противомикробным препаратам. С 2020 г. резко возросла устойчивость к азитромицину, увеличивается доля изолятов, устойчивых к ципрофлоксацину, произошло восстановление чувствительности к пенициллину, но при этом вся популяция остается чувствительной к цефтриаксону.

Разработанный и валидированный на 360 образцах набор реагентов «NG-ТЕСТ» обеспечивает быстрое определение устойчивости N. gonorrhoeae к цефтриаксону посредством одновременной идентификации генетических детерминант устойчивости в генах penA, ponA и porB и расчета значения МПК. Этот метод и другие микрочиповые технологии для определения детерминант устойчивости N. gonorrhoeae к противомикробным препаратам могут быть использованы в качестве вспомогательного инструмента выявления резистентных штаммов N. gonorrhoeae. Применение микрочиповых технологий будет способствовать как выбору правильной стратегии лечения конкретного пациента, так и сбору эпидемиологической информации, обеспечивающей возможность наблюдения за молекулярно-эпидемиологической картиной на уровне популяций.

 

***

 Участие авторов: все авторы несут ответственность за содержание и целостность всей статьи. Концепция и дизайн исследования — Б.Л. Шаскольский, Д.А. Грядунов; сбор и обработка материала — Ю.З. Шагабиева, М.В. Шпилевая; экспериментальные исследования — Д.В. Кравцов, И.Д. Кандинов, Н.Ю. Носов; обработка результатов — Б.Л. Шаскольский, Д.В. Кравцов; написание текста статьи, редактирование рукописи — Б.Л. Шаскольский, Д.А. Грядунов.

Конфликт интересов: авторы данной статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.

Источник финансирования: работа выполнена при поддержке Российского научного фонда, грант № 24-25-20084.

Authors’ participation: all authors: approval of the final version of the article, responsibility for the integrity of all parts of the article. Concept and design of the study — Boris L. Shaskolskiy, Dmitry A. Gryadunov; collection and processing of material — Julia Z. Shagabieva, Marina V. Shpilevaya; experimental investigation — Dmitry V. Kravtsov, Ilya D. Kandinov, Nikita Yu. Nosov; data analysis — Boris L. Shaskolskiy, Dmitry V. Kravtsov; text writing, editing — Boris L. Shaskolskiy, Dmitry A. Gryadunov.

Conflict of interest: the authors declare that there are no obvious and potential conflicts of interest associated with the publication of this article.

Funding source: this work was funded by the Russian Science Foundation, grant no. 24-25-20084.

About the authors

Boris L. Shaskolskiy

Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine, Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: bls@shaskolskiy.ru
ORCID iD: 0000-0002-0316-2262

Cand. Sci. (Chem.)

Россия, 32 Vavilova street, 119991 Moscow

Dmitry V. Kravtsov

Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine, Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Email: solo13.37@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-4180-6898
SPIN-code: 5381-7087
Россия, 32 Vavilova street, 119991 Moscow

Ilya D. Kandinov

Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine, Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Email: ilya9622@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9416-875X
SPIN-code: 8118-6614
32 Vavilova street, 119991 Moscow

Dmitry A. Gryadunov

Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine, Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Email: grad@biochip.ru
ORCID iD: 0000-0003-3183-318X
SPIN-code: 6341-2455

Dr. Sci. (Biol.)

Россия, 32 Vavilova street, 119991 Moscow

Marina V. Shpilevaya

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology

Email: aniram1970@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-9957-4009
SPIN-code: 6600-3311

Cand. Sci. (Biol.)

Россия, 3/6, Korolenko street,107076 Moscow

Julia Z. Shagabieva

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology

Email: shagabieva1412@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7595-0276
SPIN-code: 7270-5113

Cand. Sci. (Chem.)

Россия, 3/6, Korolenko street,107076 Moscow

Nikita Y. Nosov

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology

Email: nosovnj@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3967-8359
SPIN-code: 8806-8539

Cand. Sci. (Biol.)

Россия, 3/6, Korolenko street,107076 Moscow

References

Supplementary files