Full Text

Авторы

Шаскольский Б.Л.¹, Кравцов Д.В.¹, Кандинов И.Д.¹, Грядунов Д.А.¹, Шпилевая М.В.², Шагабиева Ю.З.², Носов Н.Ю.², Кубанов А.А.²

Организации

¹ Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины, Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта Российской академии наук, Москва, Россия

² Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии, Москва, Россия

Название статьи

Микрочиповые технологии для анализа генетических детерминант устойчивости Neisseria gonorrhoeae к противомикробным препаратам

Структурированная аннотация

Обоснование. Возбудитель гонококковой инфекции способен быстро формировать устойчивость к противомикробным препаратам. Доля лекарственно-устойчивых изолятов N. gonorrhoeae в мире растет с каждым годом, что повышает вероятность возникновения неизлечимой инфекции.

Цель исследования. Актуализация данных о распространении генетических детерминант устойчивости изолятов современной российской популяции N. gonorrhoeae к ряду противомикробных препаратов с использованием технологии гидрогелевых биочипов.

Методы. В исследование включены 360 изолятов N. gonorrhoeae, поступивших с 2019 по 2023 г. в ФГБУ «ГНЦДК» Минздрава России из специализированных медицинских организаций дерматовенерологического профиля восьми субъектов Российской Федерации. Тестирование чувствительности N. gonorrhoeae к пенициллину, цефтриаксону, тетрациклину, азитромицину и ципрофлоксацину осуществляли методом серийных разведений в агаре с определением минимальных подавляющих концентраций (МПК). Идентификацию генетических детерминант устойчивости N. gonorrhoeae к противомикробным препаратам проводили с помощью технологии гидрогелевых биочипов.

Результаты. Представлены актуальные данные по распространению генетических детерминант устойчивости N. gonorrhoeae к противомикробным препаратам. В российской популяции N. gonorrhoeae происходят активные процессы, связанные с перераспределением долей изолятов, устойчивых к разным противомикробным препаратам. С 2020 года возросла устойчивость к азитромицину, повышена доля изолятов, устойчивых к ципрофлоксацину, произошло восстановление чувствительности к пенициллину, при этом вся популяция остаётся чувствительной к цефтриаксону. Валидированный набор реагентов «NG-ТЕСТ» на основе биочипа обеспечивает быстрое определение устойчивости N. gonorrhoeae к цефтриаксону посредством одновременной идентификации генетических детерминант в генах penA, ponA и porB и расчета значения МПК.

Заключение. Применение микрочиповых технологий для идентификации детерминант устойчивости N. gonorrhoeae к противомикробным препаратам может быть использовано в качестве вспомогательного инструмента выявления резистентных штаммов. Результаты анализа на биочипах способствуют выбору стратегии лечения пациентов и обеспечивают возможность наблюдения за молекулярно-эпидемиологической картиной на уровне популяций.

Ключевые слова: Neisseria gonorrhoeae, устойчивость к противомикробным препаратам, олигонуклеотидные микрочипы

 

 

Authors

Boris S. Shaskolskiy¹, Dmitry V. Kravtsov¹, Ilya D. Kandinov¹, Dmitry A. Gryadunov¹, Julia Z. Shagabieva², Marina V. Shpilevaya², Nikita Y. Nosov², Alexey A. Kubanov²

Affiliation

¹ Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine, Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia

² Federal State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology, Moscow, Russia

Title

Microarray technologies for analysis of genetic determinants of Neisseria gonorrhoeae antimicrobial resistance

Abstract

Background: The gonococcal pathogen is capable of developing resistance to antimicrobials at a rapid rate. The proportion of drug-resistant N. gonorrhoeae isolates in the world is rising annually, which increases the likelihood of an incurable infection.

Aims: Updating data on the distribution of genetic determinants of resistance of isolates of the modern Russian population of N. gonorrhoeae to a number of antimicrobial drugs using hydrogel microarray technology.

Materials and methods: The study included 360 N. gonorrhoeae isolates collected in the Federal State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology in 2019-2023. The susceptibility of N. gonorrhoeae to penicillin, ceftriaxone, tetracycline, azithromycin, and ciprofloxacin was determined through serial dilution in agar, with the minimum inhibitory concentration (MIC) subsequently calculated. The genetic determinants of resistance in N. gonorrhoeae to antimicrobials were identified using hydrogel microarray technology.

Results: The current data on the distribution of genetic determinants of N. gonorrhoea resistance to antimicrobials are presented herein. In the Russian population of gonococcus, active processes are occurring that result in a redistribution of the proportions of isolates that are resistant to different antimicrobial drugs. Since 2020, there has been a strong increase in the proportion of isolates resistant to azithromycin, as well as an increase in the proportion of isolates resistant to ciprofloxacin. In contrast, there has been a restoration of susceptibility to penicillin, while the entire gonococcal population remains susceptible to ceftriaxone. The validated microarray-based NG-TEST diagnostic kit provides a rapid determination of the N. gonorrhoeae ceftriaxone resistance through the simultaneous identification of genetic determinants in the penA, ponA, and porB genes, as well as the calculation of the MIC value.

Conclusions: The use of microarray technologies for the identification of genetic determinants of N. gonorrhoeae antimicrobial resistance can be employed as an auxiliary tool for the identification of resistant strains. The results of microarray analysis contribute to the selection of an appropriate treatment strategy for patients and provide an opportunity to monitor the surveillance of the drug resistance at the population level.

Keywords: Neisseria gonorrhoeae, drug resistance, microarray analysis

 

 

Обоснование

Несмотря на почти столетнюю историю терапии гонококковой инфекции разнообразными противомикробными препаратами, в мире ежегодно регистрируют более 80 млн. случаев данного заболевания [1]. Возбудителем гонореи является грамотрицательная бактерия Neisseria gonorrhoeae, обладающая исключительной способностью формировать устойчивость к антибиотикам [2]. Доля лекарственно-устойчивых штаммов N. gonorrhoeae в мире повышается с каждым годом; регулярно публикуются случаи неудачной терапии гонококковой инфекции рекомендованными препаратами, обусловленной суперустойчивыми вариантами гонококка [2-4]. Эпидемиологические данные свидетельствуют, что ситуация с гонококковой инфекцией в России на протяжении двух десятилетий XXI века была и остаётся лучше, чем в странах Европы и США, несмотря на общий рост заболеваемости в последнее время: в 2021 повышение на 10,4% в сравнении с предыдущим годом, в 2022 г. – на 10,0%, за первые четыре месяца 2023 г. - на 5,5% относительно аналогичного периода 2022 г. [5].

Препаратом выбора для лечения гонококковой инфекции в Российской Федерации является цефалоспорин III поколения цефтриаксон. В российской популяции гонококка доля изолятов, устойчивых к цефтриаксону, минимальна, в работах сообщается об обнаружении только чувствительных изолятов [6]. Такое состояние нетипично на фоне общемировой тенденции роста случаев выявления устойчивых к цефалоспоринам III поколения изолятов [7-11]. Весьма непростая ситуация наблюдается в Китае, где доля устойчивых к цефтриаксону изолятов увеличилась c 2,9% в 2017 г. до 8,1% в 2022 г. [7].

Анализ чувствительности российской популяции N. gonorrhoeae к азитромицину (используемому как компонент комбинированной терапии для лечения гонококковой инфекции в большом числе стран, но не рекомендованному для терапии в России) зафиксировал рост устойчивых изолятов с 0% в 2018-2019 до 17% в 2020 г. и 9% в 2021 г. [12]. Такая доля устойчивых к азитромицину изолятов исключает его применение в соответствии с критерием ВОЗ, при котором общая доля чувствительных штаммов гонококка в отношении противомикробного препарата не должна быть ниже 95% [13]. Вместе с тем, полученные данные об устойчивости N. gonorrhoeae к азитромицину подчеркивают необходимость дальнейшего эпидемиологического наблюдения за распространением новых вариантов возбудителя гонококковой инфекции в России.

В сложившейся ситуации весьма актуальны исследования, направленные на ежегодный мониторинг российской популяции возбудителя гонококковой инфекции, включающий идентификацию генетических детерминант устойчивости как к цефтриаксону, так и к азитромицину, а также к препаратам, применявшимся для терапии гонореи ранее – пенициллину, тетрациклину и ципрофлоксацину. Для решения поставленных задач ИМБ РАН совместно с Государственным научным центром дерматовенерологии и косметологии министерства здравоохранения РФ (ФГБУ «ГНЦДК» Минздрава России) разработано несколько поколений олигонуклеотидных гидрогелевых микрочипов (биочипов), обеспечивающих точную идентификацию генетических детерминант устойчивости N. gonorrhoeae к различным противомикробным препаратам [12, 14, 15]. Особое внимание уделено анализу устойчивости к цефтриаксону, где по результатам идентификации детерминант на биочипе применяется метод машинного обучения для предсказания минимальной подавляющей концентрации (МПК) цефтриаксона [16]. Созданный подход, с описанными в настоящей работе модификациями в виде молекулярных зондов для установления принадлежности к виду N. gonorrhoeae, стал основой набора реагентов «NG-ТЕСТ» для идентификации генетических детерминант устойчивости возбудителя гонококковой инфекции Neisseria gonorrhoeae к цефалоспоринам III поколения.

Целью настоящего исследования является актуализация данных о распространении генетических детерминант устойчивости изолятов современной (2019 – 2023 г.) российской популяции N. gonorrhoeae к ряду противомикробных препаратов с использованием технологии гидрогелевых биочипов.

Методы

Объект исследования:

В исследование включены 360 клинических изолятов N. gonorrhoeae, поступивших в референс-центр ФГБУ «ГНЦДК» Минздрава России в рамках проведения мониторинга устойчивости к противомикробным препаратам возбудителей инфекций, передаваемых половым путем (в том числе в 2019 году – 123, в 2020 – 119, в 2021 – 52, в 2022 – 25, и в 2023 – 42 клинических изолята). Образцы поступали из специализированных медицинских учреждений дерматовенерологического профиля, расположенных в восьми субъектах Российской Федерации, относящихся к пяти Федеральным округам: Центральному – г. Москва (n=17) и Калужская область (n=101); Северо-Западному – Архангельская область (n=29); Южному – Астраханская область (n=23); Приволжскому – Республика Татарстан (n=20) и Республика Чувашия (n=76); Сибирскому – Омская (n=20) и Новосибирская (n=74) области.

Первичную идентификацию изолятов N. gonorrhoeae проводили в регионе их выделения по результатам микроскопического исследования и оксидазного теста [17-19]. Окончательную верификацию осуществляли в референс-центре ФГБУ «ГНЦДК» Минздрава России с использованием NH-карт на анализаторе VITEK 2 Compact (bioMérieux, Франция). В отношении грамотрицательных оксидазо-положительных диплококков, по совокупности биохимических свойств оцененных как N. gonorrhoeae с вероятностью менее чем 99%, проводили дополнительное подтверждающее исследование с использованием времяпролетного масс-спектрометра с ионизацией MALDI Microflex (Bruker Daltonics GmbH, Германия).

Тестирование чувствительности к противомикробным препаратам:

Определение чувствительности штаммов N. gonorrhoeae к противомикробным препаратам проводили методом серийных разведений в агаре в соответствии со стандартной процедурой [20] с использованием контрольного штамма N. gonorrhoeae АТСС 49226 из коллекции типовых культур микроорганизмов. Оценку чувствительности N. gonorrhoeae к противомикробным препаратам выполняли в соответствии с критериями МУК 4.2.1890-04 (https://fcgie.ru/download/elektronnaya_baza_metod_dokum/muk_1890-04.pdf, дата обращения 12 сентября 2024) для всех противомикробных препаратов, кроме азитромицина, для которого применяли критерии EUCAST (The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, Version 14.0, данные от 12 сентября 2024, http://www.eucast.org). Критерии чувствительности N. gonorrhoeae к противомикробным препаратам приведены в Таблице 1.

Таблица 1. Критерии фенотипической чувствительности N. gonorrhoeae к противомикробным препаратам.

 

Идентификация генетических детерминант устойчивости N. gonorrhoeae к противомикробным препаратам:

Выделение бактериальной ДНК выполняли с использованием набора «ДНК-Экспресс» (Литех, Россия) Оценку концентрации ДНК проводили с помощью спектрофлюориметра Qubit 3.0 (Invitrogen, США).

Анализ генетических детерминант, ассоциированных с устойчивостью к цефтриаксону, проводили с использованием серийных образцов набора реагентов «NG-ТЕСТ». Специализированный гидрогелевый биочип (Рис. 1) обеспечивал одновременное выявление следующих детерминант:

- инсерция кодона аспаргиновой кислоты в положение 345-346 гена penA и замены Ala311Val; Ile312Met; Val316Thr, Pro; Thr483Ser; Ala501Val, Thr, Pro; Asn512Tyr; Gly542Ser; Gly545Ser и Pro551Leu, Ser в мозаичных и немозаичных аллелях гена penA;

- замена Leu421Pro в гене ponA;

- замены Gly120Lys, Arg, Asp, Asn, Thr и Ala121Asp, Asn, Gly, Val, Ser в гене porB.

Биочип также включал молекулярные зонды для определения видоспецифичного для N. gonorrhoeae полиморфизма в мобильном элементе ISNgo2 (Рис. 1).

 

Рисунок 1. Схема биочипа, входящего в набор «NG-ТЕСТ» и содержащего 113 иммобилизованных олигонуклеотидных зондов. Элементы биочипа представлены в виде кружков, выделенных разными цветами исходя из анализируемого локуса, внутри них указан выявляемый маркёр. Элементы с последовательностями зондов, соответствующих дикому типу, обведены толстым контуром. Элементы с индексами «Ng+» и «Ng-» содержат зонды к полиморфным локусам из мобильного элемента ISNgo2 и служат для видовой идентификации N. gonorrhoeae. Ячейки с индексом «0» не содержат олигонуклеотидов и используются для нормировки фонового сигнала. Ячейки с индексом «М» содержат флуоресцентный маркер и необходимы для автоматической обработки гибридизационной картины биочипа.

Процедура анализа включала мультиплексную амплификацию и одновременное флуоресцентное маркирование фрагментов генома N. gonorrhoeae с последующей гибридизацией полученных продуктов на биочипе, автоматизированной регистрацией и интерпретацией результатов с использованием универсального аппаратно-программного комплекса для анализа биочипов (ИМБ РАН, Россия). По результатам анализа определяли генетические детерминанты, ассоциированные с устойчивостью N. gonorrhoeae к противомикробным препаратам.

Значение МПК цефтриаксона индивидуального изолята с идентифицированным набором генетических детерминант вычисляли с помощью регрессионной модели с 20 параметрами как описано ранее [16]. На рис. 2 представлены флуоресцентные картины и интерпретация результатов анализа на биочипах с целью идентификации мутаций и предсказания МПК цефтриаксона.

 

Рисунок 2. Флуоресцентные гибридизационные картины и интерпретация результатов анализа изолятов N. gonorrhoeae на биочипе с использованием набора реагентов «NG-ТЕСТ». Зеленым цветом отмечены элементы биочипа в которых иммобилизованные зонды сформировали совершенные гибридизационные комплексы с ДНК дикого типа. Красным цветом выделены элементы биочипа с комплексами иммобилизованных молекулярных зондов и ДНК с мутациями (в соответствии со схемой биочипа на Рис. 1). Отчеты об интерпретации результатов в виде подтверждения принадлежности анализируемой ДНК к виду N. gonorrhoeae, наличия/отсутствия мутаций в генах penA, ponA и porB и рассчитаных значений МПК цефтриаксона при анализе ДНК (a) изолята без мутаций, несущего немозаичный ген penA (МПК цефтриаксона = 0,002 мг/л); (б) изолята, обладающего мозаичным геном penA с различными заменами и множественными мутациями в генах penA, porB, ponA (МПК цефтриксона = 0,031 мг/л). Оба изолята чувствительны к цефтриаксону в соответствии с критериями МУК 4.2.1890-04.

Определение генетических детерминант устойчивости изолятов N. gonorrhoeae к азитромицину, пенициллину, тетрациклину, ципрофлоксацину проводили, как описано ранее [12, 15]. В качестве маркёров устойчивости к азитромицину рассматривали присутствие замены C2611T в 23S рРНК или генетический профиль, в котором присутствуют мозаичный аллель промотора mtrR совместно с мозаичным аллелем mtrD. Ранее была показана состоятельность данного подхода [21].

Статистический анализ

При анализе чувствительности изолятов к цефтриаксону и азитромицину сравнивали результаты определения устойчивости референсным микробиологическим и молекулярным методом и рассчитывали параметры диагностической специфичности (S_p) и чувствительности (S_n) при помощи следующих формул:

S_p = Tn/(Tn + Fp)×100%

S_n = Tp/(Tp + Fn)×100%

Где Tp – истинно положительный результат, Tn – истинно отрицательный результат, Fp – ложно положительный результат, Fn – ложно отрицательный результат.

Результаты

Устойчивость изолятов N. gonorrhoeae к цефтриаксону

Все проанализированные изоляты были чувствительны к цефтриаксону. 4,7% изолятов обладали значением МПК цефтриаксона равным 0,06 мг/л, что ниже порога устойчивости только на два разведения. Распределение генетических детерминант устойчивости в популяции с учётом МПК цефтриаксона представлено на рисунке 3. Значительная доля изолятов со сниженной чувствительностью (МПК_ЦЕФ > 0,03 мг/л) обладала заменами в генах penA (312Met, 316Thr, 501Val, 545Ser, 551Ser) и porB (120Lys). В большинстве случаев, именно сочетания мутаций в генах penA, ponA и porB, а не единичные замены, приводили к существенному снижению чувствительности к цефтриаксону. Изоляты со сниженной чувствительностью также характеризовались генетическими профилями, характерными для мозаичных аллелей penA, со следующими заменами: Ile312Met, Val316Thr, Asn512Tyr и Gly545Ser. Всего в исследуемой выборке мозаичные аллели гена penA обнаружены у 4,3% изолятов.

 

Рисунок 3. Распределение замен в генах penA, ponA и porB при разделении изолятов исследуемой выборки на группу со сниженной (МПК_ЦЕФ > 0,03 мг/л) и группу с несниженной чувствительностью к цефтриаксону (МПК_ЦЕФ ⩽ 0,03 мг/л).

Результаты сравнения значений МПК цефтриаксона, полученных методом серийных разведений, с предсказанным набором «NG-ТЕСТ» значением МПК, представлены в Таблице 2. Как видно из таблицы, предсказанные значения МПК хорошо совпадают с экспериментально измеренными. Для 78% штаммов предсказанные значения отличались не более чем на одно двукратное разведение. При анализе выборки не было получено ложно положительных результатов, все изоляты были корректно определены как чувствительные. Таким образом, современная российская популяция гонококка продолжает оставаться чувствительной к цефтриаксону.

Таблица 2. Сравнение результатов определения значения МПК цефтриаксона у штаммов N. gonorrhoeae, полученных методом серийных разведений и с использованием набора «NG-ТЕСТ».

 

Устойчивость изолятов N. gonorrhoeae к азитромицину

Доля изолятов, устойчивых к азитромицину (МПК > 1 мг/л), составила, суммарно, 11% от всей выборки. Распределение генетических профилей, ассоциированных с устойчивостью к азитромицину, при разделении изолятов на чувствительные и устойчивые представлено на рисунке 4. В изолятах, устойчивых к азитромицину, наблюдали увеличение доли генотипов с мозаичным промотором гена mtrR в сочетании с мозаичным геном mtrD. 7,5% устойчивых изолятов обладали заменами C2611T в гене 23S рРНК, причём во всех случаях они присутствовали во всех четырех копиях rrn-оперона. Не было выявлено ни одного изолята с заменами 2058G или 2059G в гене 23S рРНК. 2,5% изолятов, устойчивых к азитромицину, не содержали мутаций в анализируемых локусах mtrR, mtrD, и 23S рРНК. Наиболее характерный для устойчивых к азитромицину изолятов генетический профиль включал мозаичный ген mtrD, мозаичный промотор mtrR и замену в кодирующей области гена mtrR Ala86Thr.

 

Рисунок 4. Распределение генетических профилей локусов mtrR, mtrD и 23S рРНК в устойчивых и чувствительных к азитромицину изолятах в исследуемой выборке. По результатам сопоставления данных определения фенотипической чувствительности к цефтриаксону и азитромицину и идентификации генетических детерминант устойчивости к данным препаратам с использованием микрочиповых технологий определены диагностические характеристики молекулярных методов (Таблица 3).

Таблица 3. Сравнение результатов определения чувствительности штаммов N. gonorrhoeae к цефтриаксону и к азитромицину референсных методом серийных разведений и с использованием микрочиповых технологий.

 

Устойчивость изолятов N. gonorrhoeae к ципрофлоксацину, тетрациклину и пенициллину

Устойчивость к ципрофлоксацину. В среднем, доля изолятов, устойчивых к ципрофлоксацину (МПК ≥ 1 мг/л), составила 49%; 1% обладали промежуточной устойчивостью (МПК 0,12 – 0,5 мг/л) и 50% были чувствительны (МПК ≤ 0,06 мг/л). Распределение генетических профилей, характеризующих устойчивость N. gonorrhoeae к ципрофлоксацину, при разделении выборки изолятов на чувствительные, промежуточно устойчивые и резистентные представлено на рисунке 5.

 

Рисунок 5. Распределение генетических профилей локусов gyrA и parC в устойчивых и чувствительных к ципрофлоксацину изолятах в исследуемой выборке.

В большинстве устойчивых к ципрофлоксацину изолятов выявлялись мутации в «хинолоновом кармане», среди которых необходимо отметить замену Ser91Phe в гене gyrA. В исследуемой выборке она, как правило, не являлась изолированной, а обнаруживалась в сочетании с заменами gyrA 95Ala/Gly/Asn и/или parC 87Arg/91Gly, что приводило к резкому превышению МПК выше порога устойчивости (от 4 до 16  мг/л как для первого, так и для второго профиля соответственно).

Устойчивость к пенициллину. Доля изолятов, устойчивых к пенициллину (МПК ≥ 2 мг/л) составила 8%, 41% обладали промежуточной устойчивостью (МПК 0,12 – 1 мг/л), 50% были чувствительными (МПК ≤ 0,06 мг/л). Распределение генетических профилей, характеризующих устойчивость N. gonorrhoeae к пенициллину, при разделении выборки изолятов на чувствительные, промежуточно устойчивые и резистентные, представлено на рисунке 6.   Рисунок 6. Распределение генетических профилей локусов penA, ponA, porB и blaTEM в устойчивых и чувствительных к пенициллину изолятах в исследуемой выборке.

31% устойчивых изолятов несли плазмиду blaTEM, наличие которой повышало МПК пенициллина до 4-32 мг/л. Замена в гене ponA Leu421Pro, в сочетании с мутациями в генах penA и porB, встречалась в 55% устойчивых изолятов. Существенная доля чувствительных изолятов обладали изолированной вставкой аспартата в кодоне 345 гена penA. Наиболее характерный для устойчивых к пенициллину изолятов генетический профиль включал замену в гене ponA Leu421Pro, вставку аспартата в кодоне 345 гена penA с заменой Gly542Ser в этом же гене и мутацию Gly120Lys в гене porB.

Устойчивость к тетрациклину. В среднем, доля изолятов, устойчивых к тетрациклину (МПК ≥ 2 мг/л) составила 21%, 30% обладали промежуточной устойчивостью (МПК 0,5 – 1 мг/л), 43% были чувствительными (МПК ≤ 0,25 мг/л). Распределение генетических профилей, характеризующих устойчивость N. gonorrhoeae к тетрациклину, при разделении выборки изолятов на чувствительные, промежуточно устойчивые и резистентные, представлено на рисунке 7.

 

Рисунок 7. Распределение генетических профилей локусов rpsJ, mtrR, porB и tetM в устойчивых и чувствительных к тетрациклину изолятах в исследуемой выборке.

62% изолятов, устойчивых к тетрациклину, несли коньюгативную плазмиду tetM, наличие которой повышало МПК тетрациклина до 4-16 мг/л  Изолированная мутация в кодирующей области гена mtrR Ala86Thr существенно чаще встречалась в чувствительных изолятах. Наиболее характерный для устойчивых к тетрациклину изолятов без конъюгативной плазмиды генетический профиль включал замену Val57Met в гене rpsJ, делецию аденина в положении -35 промотора гена mtrR и замену Ala86Thr в этом же гене, а также мутацию Gly120Lys в гене porB.

 

Динамика устойчивости изолятов N. gonorrhoeae к противомикробным препаратам в 2019 – 2023 г.

Анализ распространения генетических профилей, характеризующих устойчивость N. gonorrhoeae к противомикробным препаратам, показывает различные тенденции в распространении характерных детерминант, вносящих наибольший вклад в повышение МПК. Доли изолятов с характерными генетическими детерминантами устойчивости к ципрофлоксацину, пенициллину, тетрациклину и азитромицину в 2019-2023 г. представлены на рис. 8.

 

Рисунок 8. Динамика встречаемости в 2019-2023 г. изолятов N. gonorrhoeae, устойчивых к пенициллину (а), тетрациклину (б), ципрофлоксацину (в), азитромицину (г), обладающих генетическими детерминантами, вносящими наибольший вклад в повышение МПК. Линиями обозначено изменение долей характерных генетических детерминант. Столбцы гистограммы отражают ежегодную долю изолятов с фенотипической устойчивостью к соответствующему противомикробному препарату.

Исчезновение изолятов, устойчивых к пенициллину, происходит на фоне ухода из популяции (по крайней мере, в анализируемой выборке) штаммов с плазмидным геном blaTEM и снижения доли изолятов с хромосомными детерминантами устойчивости - заменой в гене ponA Leu421Pro и вставкой аспартата в кодоне 345 гена penA.

Обратная тенденция наблюдается при анализе устойчивости к тетрациклину: регистрируется рост доли изолятов с хромосомными детерминантами, локализованными в генах rpsJ, mtrR и porB. Особо следует отметить сохранение штаммов с плазмидным геном tetM – наиболее «мощной» детерминантой устойчивости к тетрациклину.  В целом, доля изолятов, устойчивых тетрациклину, остается на стабильно высоком уровне (~30%).

Ежегодное повышение доли устойчивых к ципрофлоксацину изолятов подтверждается соответствующими детерминантами в генах gyrA и parC, включающих в себя, в том числе, замену Ser91Phe в gyrA. Тенденции к снижению устойчивости N. gonorrhoeae к фторхинолонам в России в настоящее время не наблюдается.

В 2019 г. не было выявлено ни одного устойчивого к азитромицину изолята. Их появление датировано 2020 г. с закреплением в российской популяции гонококка штаммов, обладающих мозаичным промотором гена mtrR вместе с мозаичным геном mtrD. В то же время, изоляты с мутациями в гене 23S рРНК остаются редкими: за рассматриваемый период было выявлено только три изолята с полиморфизмом С2611T.

Обсуждение

Результаты данного исследования показывают, что устойчивость гонококка к цефтриаксону в России соответствует критерию ВОЗ для применения антибиотика (доля чувствительных изолятов в популяции более 95%). В то же время, почти 5% выявленных изолятов со сниженной чувствительностью (МПК > 0,03 мг/л) к цефтриаксону и распространение устойчивых штаммов по всему миру, в совокупности с применением цефтриаксона в качестве противомикробного препарата выбора, обусловливает важность использования молекулярных методов для анализа устойчивости N. gonorrhoeae к данному препарату.

С 2020 г. зарегистрировано появление и закрепление в российской популяции гонококка изолятов, резистентных к азитромицину, ранее встречавшихся только спорадически [22]. Ввиду существенной доли таких изолятов, превышающей критерий ВОЗ, целесообразность применения этого препарата для терапии гонококковой инфекции поставлена под сомнение в общем случае.

В исследовании изолятов, полученных в России в 2005-2016 г, была отмечена тенденция к снижению устойчивости к пенициллину, тетрациклину и ципрофлоксацину, связанная с исключением данных препаратов из схем терапии [22]. Результаты настоящей работы показывают, что такая тенденция сохраняется только для пенициллина. Сохраняется доля штаммов с промежуточной устойчивостью (или штаммов, устойчивых при повышенной экспозиции) при сокращении и элиминации изолятов с истинно резистентным к пенициллину фенотипом. Интересной особенностью популяции 2022-2023 годов стала очень малая доля изолятов с плазмидным геном blaTEM, при сохранении изолятов с плазмидами tetM. Ранее показано, что коньюгативная плазмида tetM у N. gonorrhoeae может способствовать переносу в клетку других плазмид, в том числе blaTEM, [23] которые часто обнаруживаются совместно с плазмидами tetM [24]. Несмотря на прекращение использования ципрофлоксацина для терапии гонореи, наблюдается рост изолятов с множественными детерминантами устойчивости во фторхинолоновом кармане (в генах gyrA и parC) и сохранение стабильно высокой доли изолятов, устойчивых к ципрофлоксацину. В отсутствие селективного давления препарата эти мутации должны негативно воздействовать на бактериальный фитнесс, однако данный процесс парадоксальным образом не сопровождается быстрой элиминацией соответствующих вариантов из популяции N. gonorrhoeae.

Разработанные микрочиповые технологии валидированы с использованием 360 клинических изолятов. Диагностическая специфичность набора реагентов «NG-ТЕСТ» составила 100%, при этом не было получено ни одного ложно отрицательного результата. Отличительной особенностью созданного метода является не просто разделение изолятов на чувствительные и устойчивые, но и определение значения МПК цефтриаксона для анализируемого образца. В настоящем исследовании метод показал хорошую сходимость с фенотипическим определением МПК для 78% изолятов. Помимо предсказания МПК, разработанный метод предоставляет данные о наличии генетических детерминант лекарственной устойчивости к цефалоспоринам, а значит, пригоден как для решения задач клинической лабораторной диагностики, так и для решения задач молекулярной эпидемиологии гонококка.

При определении устойчивости к азитромицину с использованием биочипа получены значения диагностической чувствительности и специфичности 88% и 93%, соответственно. Эти характеристики сопоставимы с результатами, получаемыми при анализе данных полногеномного секвенирования азитромицин-устойчивых изолятов N. gonorrhoeae. Согласно данным базы  Pathogenwatch, чувствительность и специфичность такого метода составляет  72% и 100%, соответственно [25].

Определенный интерес для молекулярной эпидемиологии также представляют описанные ранее биочипы [12, 14, 15], позволяющие получать данные о детерминантах устойчивости N. gonorrhoeae к применявшимся ранее ципрофлоксацину, пенициллину и тетрациклину. При анализе популяции гонококка показано, что для предсказания чувствительности изолята к противомикробным препаратам необходимо учитывать генетический профиль из мутаций в разных локусах, при этом вклад каждой мутации в фенотипическую чувствительность в общем случае различен. Использование микрочиповых технологий позволит в перспективе осуществлять динамическое наблюдение путей переноса N. gonorrhoeae в регионах, улучшить систему эпидемиологического наблюдения и эффективность лечения гонореи.

Заключение

В российской популяции N. gonorrhoeae происходят активные процессы, связанные с перераспределением долей изолятов, устойчивых к разным противомикробным препаратам. С 2020 года резко возросла устойчивость к азитромицину, растёт доля изолятов, устойчивых к ципрофлоксацину, произошло восстановление чувствительности к пенициллину, но при этом вся популяция остаётся чувствительной к цефтриаксону. Разработанный и валидированный на 360 образцах набор реагентов «NG-ТЕСТ» обеспечивает быстрое определение устойчивости N. gonorrhoeae к цефтриаксону посредством одновременной идентификации генетических детерминант устойчивости в генах penA, ponA и porB и расчета значения МПК. Этот метод и другие микрочиповые технологии для определения детерминант устойчивости N. gonorrhoeae к противомикробным препаратам могут быть использованы в качестве вспомогательного инструмента выявления резистентных штаммов N. gonorrhoeae. Применение микрочиповых технологий будет способствовать как выбору правильной стратегии лечения конкретного пациента, так и сбору эпидемиологической информации, обеспечивающей возможность наблюдения за молекулярно-эпидемиологической картиной на уровне популяций.

Источник финансирования

Работа выполнена при поддержке Соглашения с Министерством науки и высшего образования РФ № 075-15-2019-1660 на осуществление государственной поддержки создания и развития центра геномных исследований мирового уровня "Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины" ИМБ РАН в рамках реализации Федеральной научно-технической программы развития генетических технологий на 2019 - 2027 годы.

Участие авторов

Все авторы несут ответственность за содержание и целостность всей статьи.

Концепция и дизайн исследования — Б.Л. Шаскольский, Д.А. Грядунов; сбор и обработка материала — Ю.З. Шагабиева, М.В. Шпилевая; экспериментальные исследования — Д.В. Кравцов, И.Д. Кандинов, Н.Ю. Носов; обработка результатов — Б.Л. Шаскольский, Д.В. Кравцов; написание текста статьи — Б.Л. Шаскольский, Д.А. Грядунов; редактирование рукописи — А.А. Кубанов.

 

All authors: approval of the final version of the article, responsibility for the integrity of all parts of the article.

Concept and design of the study — Boris L. Shaskolskiy and Dmitry A. Gryadunov; collection and processing of material — Julia Z. Shagabieva and Marina V. Shpilevaya; experimental investigation — Dmitry V. Kravtsov, Ilya D. Kandinov, Nikita Y. Nosov; data analysis — Boris L. Shaskolskiy and Dmitry V. Kravtsov; text writing — Boris L. Shaskolskiy and Dmitry A. Gryadunov; editing — Alexey A. Kubanov.

Конфликт интересов

Авторы данной статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.

Литература

1. Global health sector strategies on, respectively, HIV, viral hepatitis and sexually transmitted infections for the period 2022-2030. WHO ‒ Geneva, Switzerland: World Health Organization. 2022. https://www.who.int/publications/i/item/9789240053779
2. Shaskolskiy B, Kandinov I, Demetieva E, Gryadunov D. Antibiotic Resistance in Neisseria gonorrhoeae: Challenges in Research and Treatment. Microorganisms. 2022; 10 (9): 1699. doi: 10.3390/microorganisms10091699
3. Maubaret C, Caméléna F, Mrimèche M, Braille A, Liberge M, Mainardis M, et al. Two cases of extensively drug-resistant (XDR) Neisseria gonorrhoeae infection combining ceftriaxone-resistance and high-level azithromycin resistance, France, November 2022 and May 2023. Euro Surveill. 2023; 28 (37): 2300456. doi: 10.2807/1560-7917.ES.2023.28.37.2300456
4. Pleininger S, Indra A, Golparian D, Heger F, Schindler S, Jacobsson S, et al. Extensively drug-resistant (XDR) Neisseria gonorrhoeae causing possible gonorrhoea treatment failure with ceftriaxone plus azithromycin in Austria, April 2022. Euro Surveill. 2022; 27 (24): 2200455. doi: 10.2807/1560-7917.ES.2022.27.24.2200455
5. Красносельских Т. В., Соколовский Е. В., Рахматулина М. Р., Новоселова Е. Ю., Мелехина Л. Е. Заболеваемость сифилисом и некоторыми другими ИППП в Российской Федерации: прошлое, настоящее и пути достижения контроля эпидемиологической ситуации в будущем. Вестник дерматологии и венерологии. 2023; (4) :41-59. doi: 10.25208/vdv13726 [Krasnoselskikh TV, Sokolovskiy EV, Rakhmatulina MR, Novoselova EY, Melekhina LE. Syphilis and some other STIs in the Russian Federation: past, present and ways to control of the epidemiological situation in the future. Vestnik dermatologii i venerologii. 2023; (4): 41-59. doi: 10.25208/vdv13726. (In Russ.)]
6. Шагабиева Ю. З., Носов Н. Ю., Шпилевая М. В., Дерябин Д. Г., Образцова О. А., Никонорова Е. Р., Соломка В. С., Кубанов А. А. Анализ динамики устойчивости Neisseria gonorrhоeaе к антимикробным препаратам в РФ за период 2005–2021 гг. Вестник дерматологии и венерологии. 2023; (3): 53-62. doi: 10.25208/vdv1410 [Shagabieva JZ, Nosov NY, Shpilevaya MV, Deryabin DG, Obraztsova OA, Nikonorova ER, Solomka VS, Kubanov AA. Analysis of the dynamics of Neisseria gonorrhоeaе resistance to antimicrobial drugs in the Russian Federation for the period 2005–2021. Vestnik dermatologii i venerologii. 2023; (3): 53-62. doi: 10.25208/vdv1410. (In Russ.)]
7. Xiaoyu Z, Yue Xi, Xiangdong G, Shaochun C. Ceftriaxone-Resistant Gonorrhea — China, 2022. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 2024; (73): 255–259.
8. Reimche JL, Pham CD, Joseph SJ, Hutton S, Cartee JC, Ruan Y, et al. Novel strain of multidrug non-susceptible Neisseria gonorrhoeae in the USA. Lancet Infect. Dis. 2024; 24 (3): e149-e151. doi: 10.1016/S1473-3099(23)00785-5
9. Day M, Pitt R, Mody N, Saunders J, Rai R, Nori A, et al. Detection of 10 cases of ceftriaxone-resistant Neisseria gonorrhoeae in the United Kingdom, December 2021 to June 2022. Euro Surveill. 2022; 27(46) :2200803. doi: 10.2807/1560-7917.ES.2022.27.46.2200803
10. Crucitti T, Belinga S, Fonkoua M, Abanda M, Mbanzouen W, Sokeng E, et al. Sharp increase in ciprofloxacin resistance of Neisseria gonorrhoeae in Yaounde, Cameroon: analyses of a laboratory database period 2012–2018. Int. J. STD. AIDS. 2020; 31 (6): 579-586. doi: 10.1177/0956462419897227
11. Caméléna F, Mérimèche M, Brousseau J, Mainardis M, Verger P, Le Risbé C, et al. Emergence of Extensively Drug-Resistant Neisseria gonorrhoeae France, 2023. Emerg. Infect. Dis. 2024; 30 (9): 1903-1906. doi: 10.3201/eid3009.240557
12. Kandinov I, Dementieva E, Filippova M, Vinokurova A, Gorshkova S, Kubanov A, et al. Emergence of Azithromycin-Resistant Neisseria gonorrhoeae Isolates Belonging to the NG-MAST Genogroup 12302 in Russia. Microorganisms. 2023; 11 (5): 1226. doi: 10.3390/microorganisms11051226
13. Updated recommendations for the treatment of Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, and Treponema pallidum (‎syphilis)‎ and new recommendations on syphilis testing and partner services. World Health Organization. 2024. https://www.who.int/publications/i/item/9789240090767
14. Gryadunov DA, Shaskolskiy BL, Nasedkina TV, Rubina AY, Zasedatelev AS. The EIMB Hydrogel Microarray Tech-nology: Thirty Years Later. Acta Naturae. 2018; 10 (4) :4-18. doi: 10.32607/20758251-2018-10-4-4-18
15. Shaskolskiy B, Kandinov I, Kravtsov D, Vinokurova A, Gorshkova S, Filippova M, et al. Hydrogel Droplet Microarray for Genotyping Antimicrobial Resistance Determinants in Neisseria gonorrhoeae Isolates. Polymers. 2021; 13 (22): 3889. doi: 10.3390/polym13223889
16. Shaskolskiy B, Kandinov I, Kravtsov D, Filippova M, Chestkov A, Solomka V, et al. Prediction of ceftriaxone MIC in Neisseria gonorrhoeae using DNA microarray technology and regression analysis. J Antimicrob Chemother. 2021;76(12):3151-3158. doi: 10.1093/jac/dkab308
17. Стандартные операционные процедуры по забору клинического материала у пациентов с подозрением на гонококковую инфекцию СОП № ГОН 002/04. Москва: ООО «ДЭКС-ПРЕСС». 2008. 20 с.
18. Стандартные операционные процедуры по транспортировке и доставке клинического материала и выделенных культур возбудителя гонореи СОП № ГОН 001/03. Москва: ООО «ДЭКС-ПРЕСС». 2008. 17 с.
19. Стандартные операционные процедуры по проведению видовой идентификации возбудителя гонореи СОП № ГОН 003/04, СОП № ГОН 004/04, СОП № 005/04. Москва: ООО «ДЭКС-ПРЕСС». 2008. 29 с.
20. Стандартные операционные процедуры по методам определения чувствительности гонококкак антибактериальным препаратам. Москва: ООО «ДЭКС-ПРЕСС». 2008. 16 с.
21. Kandinov I, Shaskolskiy B, Kravtsov D, Vinokurova A, Gorshkova S, Kubanov A, et al. Azithromycin Susceptibility Testing and Molecular Investigation of Neisseria gonorrhoeae Isolates Collected in Russia, 2020-2021. Antibiotics. 2023; 12 (1): 170. doi: 10.3390/antibiotics12010170
22. Kubanov A, Solomka V, Plakhova X, Chestkov A, Petrova N, Shaskolskiy B, et al. Summary and Trends of the Russian Gonococcal Antimicrobial Surveillance Programme, 2005 to 2016. J. Clin. Microbiol. 2019; 57 (6): e02024-18. doi: 10.1128/JCM.02024-18
23. Roberts MC, Knapp JS. Transfer of beta-lactamase plasmids from Neisseria gonorrhoeae to Neisseria meningitidis and commensal Neisseria species by the 25.2-megadalton conjugative plasmid. Antimicrob. Agents Chemother. 1988; 32 (9): 1430-1432. doi: 10.1128/AAC.32.9.1430
24. Shaskolskiy B, Dementieva E, Kandinov I, Filippova M, Petrova N, Plakhova X, Chestkov et al. Resistance of Neisseria gonorrhoeae isolates to beta-lactam antibiotics (benzylpenicillin and ceftriaxone) in Russia, 2015–2017. PLoS One. 2019; 14 (7): e0220339. doi: 10.1371/journal.pone.0220339
25. Sánchez-Busó L, Yeats CA, Taylor B, Goater RJ, Underwood A, Abudahab K, et al. A community-driven resource for genomic epidemiology and antimicrobial resistance prediction of Neisseria gonorrhoeae at Pathogenwatch. Genome Med. 2021; 13 (1): 61. doi: 10.1186/s13073-021-00858-2

Таблицы

Таблица 1. Критерии фенотипической чувствительности N. gonorrhoeae к противомикробным препаратам.

Противомикробный препарат (Ч*;УР*;Р* мг/л)

Пенициллин (≤0,06; 0,12–1,0; ≥2,0)

Цефтриаксон (≤0, 25; – ; >0, 25)

Тетрациклин (≤0,25; 0,5–1,0; ≥2,0)

Азитромицин (≤1,0; - ; >1,0)**

Ципрофлоксацин (≤0,03; 0,06; >0,06)

Примечания: *Ч — чувствительный; *УР — умеренно резистентный; Р* — резистентный.

**Азитромицин всегда используется в сочетании с другим эффективным средством. В МУК 4.2.1890-04 отсутствуют указания об азитромицине, в связи с чем использовали EUCAST 14.0, в котором порог устойчивости ECOFF составляет 1 мг/л.

 

Таблица 2. Сравнение результатов определения значения МПК цефтриаксона у штаммов N. gonorrhoeae, полученных методом серийных разведений и с использованием набора «NG-ТЕСТ».

фенотипические данные		предсказанная МПКцеф, мг/л
МПКцеф, мг/л	число образцов	среднее геометрическое
0,0015	1	0,005
0,002	114	0,0039
0,004	77	0,0077
0,008	76	0,0091
0,015	39	0,0135
0,03	36	0,009
0,06	17	0,0081

 

Таблица 3. Сравнение результатов определения чувствительности штаммов N. gonorrhoeae к цефтриаксону и к азитромицину референсных методом серийных разведений и с использованием микрочиповых технологий.

Препарат	Характеристика устойчивости	Число изолятов с соответствующим фенотипом	Наличие детерминант устойчивости	Чувстви-тельность %	Специфич-ность %
Цефтриаксон	Чувствительные	360	0	-	100%
	Устойчивые	0	0
Азитромицин	Чувствительные	339	24	88%	93%
	Устойчивые	21	18

 

Контактная информация

Автор, ответственный за переписку:

Шаскольский Борис Леонидович, к.х.н. [Boris L. Shaskolskiy, Cand. Sci. (Chem.)]; адрес: Россия, 119991, Москва, улица Вавилова, д.32 [address: 32 Vavilova street, 119991 Moscow, Russia]; телефон: 8 (915) 465-53-39; ORCID: 0000-0002-0316-2262; eLibrary SPIN: 2374-4539; e-mail: bls@shaskolskiy.ru.

Соавторы:

Кравцов Дмитрий Витальевич [Dmitry V. Kravtsov]; адрес: Россия, 119991, Москва, улица Вавилова, д.32 [address: 32 Vavilova street, 119991 Moscow, Russia]; телефон: 8 (499) 135-98-46; ORCID: 0000-0003-4180-6898; eLibrary SPIN: 5381-7087; e-mail: solo13.37@yandex.ru.

Кандинов Илья Денисович, к.б.н. [Ilya D. Kandinov, Cand. Sci. (Biol.)]; адрес: Россия, 119991, Москва, улица Вавилова, д.32 [address: 32 Vavilova street, 119991 Moscow, Russia]; телефон: 8 (499) 135-98-46; ORCID: 0000-0001-9416-875X; eLibrary SPIN: 8118-6614; e-mail: ilya9622@gmail.com.

Грядунов Дмитрий Александрович, д.б.н. [Dmitry A. Gryadunov, Dr. Sci. (Biol.)]; адрес: Россия, 119991, Москва, улица Вавилова, д.32 [address: 32 Vavilova street, 119991 Moscow, Russia]; телефон: 8 (499) 135-98-46; ORCID: 0000-0003-3183-318X; eLibrary SPIN: 6341-2455; e-mail: grad@biochip.ru.

Шпилевая Марина Валентиновна, к.б.н. [Marina V. Shpilevaya, Cand. Sci. (Biol.)]; адрес: Россия, 107076, Москва, ул. Короленко, д. 3, стр. 6 [address: bldg 6 Korolenko street, 107076 Moscow, Russia]; телефон: 8 (499) 785-20-15; ORCID: 0000-0002-9957-4009; eLibrary SPIN: 6600-3311; e-mail: aniram1970@list.ru.

Шагабиева Юлия Зинуровна, к.х.н. [Julia Z. Shagabieva, Cand. Sci. (Chem.)]; адрес: Россия, 107076, Москва, ул. Короленко, д. 3, стр. 6 [address: bldg 6 Korolenko street, 107076 Moscow, Russia]; телефон: 8 (499) 785-20-15; ORCID: 0000-0002-7595-0276; eLibrary SPIN: 7270-5113; e-mail: shagabieva1412@mail.ru.

Носов Никита Юрьевич, к.б.н. [Nikita Y. Nosov, Cand. Sci. (Biol.)]; адрес: Россия, 107076, Москва, ул. Короленко, д. 3, стр. 6 [address: bldg 6 Korolenko street, 107076 Moscow, Russia]; телефон: 8 (499) 785-20-15; ORCID: 0000-0002-3967-8359; eLibrary SPIN: 8806-8539; e-mail: nosovnj@mail.ru.

Кубанов Алексей Алексеевич, д.м.н., профессор, академик РАН [Alexey A. Kubanov, MD, Dr. Sci. (Med.), Professor, Academician of the Russian Academy of Sciences]; адрес: Россия, 107076, Москва, ул. Короленко, д. 3, стр. 6 [address: bldg 6 Korolenko street, 107076 Moscow, Russia]; телефон: 8 (499) 785-20-15; ORCID: 0000-0002-7625-0503; eLibrary SPIN: 8771-4990; e-mail: alex@cnikvi.ru.

About the authors

Boris Shaskolskiy

Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, 119991 Moscow, Russia

Author for correspondence.
Email: bls@shaskolskiy.ru
ORCID iD: 0000-0002-0316-2262
Россия

Dmitry Kravtsov

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН)

Email: solo13.37@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-4180-6898
SPIN-code: 5381-7087

Ilya Kandinov

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН)

Email: ilya9622@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9416-875X
SPIN-code: 8118-6614

Dmitry Gryadunov

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН)

Email: grad@biochip.ru
ORCID iD: 0000-0003-3183-318X
SPIN-code: 6341-2455

Marina V. Shpilevaya

Federal State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology

Email: aniram1970@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-9957-4009
SPIN-code: 6600-3311

Cand. Sci. (Biol.)

Россия, Moscow

Julia Z. Shagabieva

Federal State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology

Email: shagabieva1412@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7595-0276
SPIN-code: 7270-5113

Cand. Sci. (Chem.)

Россия, Moscow

Nikita Y. Nosov

Federal State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology

Email: nosovnj@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3967-8359
SPIN-code: 8806-8539

Cand. Sci. (Biol.)

Россия, Moscow

Alexey A. Kubanov

State Research Centre of Dermatovenereology and Cosmetology

Email: alex@cnikvi.ru
ORCID iD: 0000-0002-7625-0503
SPIN-code: 8771-4990
Scopus Author ID: 6506502738

MD, PhD, Professor, Academician of the Russian Academy of Sciences

Россия, 3 bldg 6, Korolenko street,107076 Moscow

References

Supplementary files