Mechanisms of the formation of Neisseria gonorrhoeae resistance to cephalosporins

Full Text

Одним из важных условий успешной терапии гонококковой инфекции является определение чувствительности возбудителя N. gonorrhoeae, выделенного от больного, к антимикробным препаратам (АМп). Однако на практике при первичном обследовании пациента это исследование ввиду его трудоемкости и длительности либо отсутствия в медицинской организации налаженной культуральной диагностики гонококковой инфекции нередко не проводится, что вызы вает необходимость определения антимикробных препаратов выбора для терапии гонококковой инфекции. Следует отметить, что в последние десятилетия в связи с возникновением устойчивости N. gonorrhoeae к АМп и широким распространением штаммов N. gonorrhoeae, резистентных к различным группам АМп, происходит смена препаратов выбора, применяемых для лечения гонококковой инфекции. Так, в 1987 г. на смену пенициллину, а затем и тетрациклинам приш © Н.В. Фриго и соавт., 2012 Vestn Dermatol Venerol 2012; 5: 44—51. Контактная информация: frigo@cnikvi.ru Обзор литературы А 45 ли фторхинолоны и цефалоспорины третьего поколения [1]. Однако с середины 1990-х годов прошлого века начали появляться сообщения о неудачах в лечении гонококковой инфекции с применением фторхинолов и участившихся случаях резистентности к ним штаммов N. gonorrhoeae [2—4]. Широкое распространение резистентности N. gonorrhoeae к фторхинолонам привело к их исключению из схем эмпирической терапии гонококковой инфекции в странах Европы и США [5, 6]. С 2010 г. на основании результатов многолетнего мониторинга резистентности N. gonorrhoeae к АМп, проводившегося на территории Российской федерации при научно-методическом и организационном руководстве Государственного научного центра дерматовенерологии и косметологии Минздрава России, фторхинолоны были исключены из схем терапии гонококковой инфекции на территории Рф [7]. препаратами выбора, рекомендуемыми для лечения гонококковой инфекции, в настоящее время являются цефалоспорины третьего поколения [8, 9], в частности цефтриаксон и цефиксим [10]. Однако в последние годы все чаще появляются сообщения о выявлении штаммов N. gonorrhoeae со сниженным уровнем чувствительности к цефалоспоринам [11—16]. первые случаи неудачного лечения гонококковой инфекции цефалоспоринами третьего поколения были описаны в начале 2000 г. [17, 18], а в 2011 г. был впервые выделен резистентный к цефалоспоринам штамм N. gonorrhoeae [19]. Имеющихся к настоящему времени данных вполне достаточно, чтобы понять важность и необходимость исследований, направленных на выяснение молекулярных механизмов развития такой устойчивости. представление об этих механизмах должно быть учтено при создании АМп как той же биохимической группы, так и принципиально новых. цефалоспорины, как и пенициллины, по своей структуре относятся к большой группе β-лактамов, и снижение чувствительности N. gonorrhoeae к цефалоспоринам может быть связано с общими для β-лактамов механизмами развития резистентности [20]. К настоящему времени уже известны различные молекулярные механизмы устойчивости N. gonorrhoeae к пенициллинам; возможно, некоторые из них могут играть важную роль и в снижении чувствительности N. gonorrhoeae к цефалоспоринам. Можно предположить, что в результате продолжительного применения различных АМп у N. gonorrhoeae, как и у многих других микроорганизмов, сформировались два основных пути формирования антибиотико-резистентности: приобретение новых для бактерии генов — детерминант резистентности и изменения в собственном геноме. Новые для бактерий гены резистентности переносятся с помощью подвижных генетических элементов — плазмид и транспозонов в результате их горизонтального переноса. чаще все го с подвижными элементами передаются и гены ферментов, инактивирующих антибиотики. К изменению собственного генома относится появление мутаций в генах, кодирующих мишени действия антибиотиков, систему эффлюкса, а также пориновых каналов [21]. устойчивость N. gonorrhoeae к пенициллинам чаще всего обусловлена наличием гена пенициллиназы (TEM-1 β-лактамазы), кодирующего фермент, разрушающий β-лактамное кольцо антибиотика [9, 22]. Однако следует отметить, что цефалоспориназа, характерная для некоторых других микроорганизмов [23], у N. gonorrhoeae до сих пор не обнаружена [24]. К хромосомным механизмам формирования устойчивости N. gonorrhoeae к β-лактамам относят в первую очередь появление мутаций в генах ponA и penA, приводящих к снижению аффинности пенициллинсвязы-вающих белков [25]. Изменение нуклеотидного состава в гене ponA приводит к замене аминокислоты Leu на pro в положении 421 белковой цепи [26], а инсер-ция трех нуклеотидов в гене penA приводит к появлению аминокислоты Asp в положении 345 [27]. помимо модификации белков-мишеней причиной формирования устойчивости N. gonorrhoeae к β-лактамам может быть изменение проницаемости клеточной стенки и/или системы эффлюкса. при этом важную роль в развитии резистентности играют специфические мутации в промотере и кодирующей части гена mtrR, посредством которых через снятие репрессии увеличивается число MtrC-MtrD-MtrE-помп эффлюкса [28]. увеличение количества помп эф-флюкса приводит к развитию устойчивости микроорганизмов к некоторым гидрофильным антибиотикам, в том числе и к пенициллинам [29]. Еще одной молекулой, участвующей в формировании устойчивости N. gonorrhoeae к пенициллину, является белок наружной мембраны — порин porb1b. Мутации в кодирующем его гене penB приводят к снижению проницаемости мембраны для гидрофильных антибиотиков [30]. Однако эти мутации не повышают резистентность микроорганизма к β-лактамам при отсутствии мутации в гене mtrR. это дает основания предполагать, что MtrC-MtrD-MtrE-помпа и porb1b, работая совместно, вызывают повышение устойчивости N. gonorrhoeae к пенициллину путем ограничения концентрации антибиотика в периплазме микроорганизма [31]. помимо перечисленных выше механизмов устойчивости N. gonorrhoeae к пенициллинам можно добавить, что мутации или делеция гена pilQ2 (ранее называвшегося penC) повышают пенициллиноустойчи-вость N. gonorrhoeae, если при этом присутствуют детерминанты устойчивости в генах penA, mtrR и penB. это происходит предположительно потому, что pilQ формирует во внешней мембране N. gonorrhoeae поры, через которые антибиотики диффундируют в пери 46 к № 5, 2012 плазму [32]. Однако роль мутаций в гене pilQ в возникновении резистентности N. gonorrhoeae к β-лактамам окончательно не установлена [33]. В настоящее время группы ученых из японии, США и Австралии ведут исследования молекулярно-генетических механизмов устойчивости N. gonorrhoeae к цефалоспоринам, и из всех вышеописанных механизмов особое место отводится роли пенициллинсвязываю-щего белка РВР2. Большое значение для понимания механизмов развития резистентности N. gonorrhoeae к цефалоспоринам имеет работа M. ito и соавт. [34], подробно изучивших взаимосвязь снижения чувствительности N. gonorrhoeae к цефиксиму и мозаичной структуры гена penA, кодирующего белок РВР2, которая, как полагают, является результатом межвидовой генетической рекомбинации N. gonorrhoeae, N. cinera и N. per-flava. Наличие мозаичности в структуре РВР2 у штаммов N. gonorrhoeae со сниженной чувствительностью к цефалоспоринам отмечалась и ранее [25], но именно в исследовании М. ito и соавт. был проведен ее тщательный анализ. Кроме того, М. ito и соавт. было предложено классифицировать все полученные последовательности белка РВР2 на группы, исходя из расположения мутаций в гене penA, т. е. по характеру мозаичности гена. этой классификацией многие исследователи пользуются до сих пор [12, 35], однако становится ясно, что для развития антибиотикорези-стентности имеет значение не сам факт мозаичности, а наличие конкретных мутаций, возможные варианты сочетаний и их количество. пока не ясно, какие именно мутации РВР2 определяют снижение чувствительности к цефалоспоринам у штаммов N. gonorrhoeae. Так, в исследовании В. whiley и соавт., направленном на выявление мутаций в белковой цепи РВР2 у штаммов N. gonorrhoeae, выделенных в период с 1988 по 2005 г., было показано, что 22 из 25 штаммов с мутацией A501v в белковой цепи, отнесенных к Xiii типу по ito, имели сниженную чувствительность к цеф-триаксону [35]. Анализ показал, что такая мутация повышает минимальную подавляющую концентрацию (МпК) цефиксима и других цефалоспоринов в 2—4 раза [36]. Согласно работам М. ito и соавт. [34] и R. Lindberg и соавт. [33], замена аминокислоты в позиции 501 также присутствовала у некоторых гонококков со сниженной чувствительностью к цеф-триаксону, но не была отнесена к какой-либо группе по характеру расположения мутаций. В экспериментах S. Takahata и соавт. [36] отмечалось, что основной мутацией в гене penA, приводящей к изменению структуры РВР2 и двух- или четырехкратному увеличению резистентности N. gonorrhoeae к цефалоспоринам, является мутация, приводящая к замене глицина на серин в положении 545 белковой цепи (G545S). замена изолейцина в положении 312 на метионин (i312M) и валина в позиции 316 белковой цепи на треонин (v316T) в присутствии мутации G545S снижала чувствительность N. gonorrhoeae к цефикси-му, цефибутену и цефподоксиму еще в 4 раза. Таким образом, важную роль для развития резистентности N. gonorrhoeae к цефалоспоринам, по-видимому, могут играть мутации, приводящие к следующим аминокислотным заменам в РВР2: G545S, i312M, v316T, A501v. позднее группой исследователей под руководством J. Tomberg был проведен ряд экспериментов, которые подтвердили ключевую роль четырех аминокислотных замен, описанных S. Takahata, в развитии антибиотикоустойчивости N. gonorrhoeae, в особенности по отношению к цефиксиму [10]. Вместе с тем было установлено, что наличие только трех ключевых мутаций в гене penA, приводящих к заменам аминокислот, а именно G545S, i312M, и v316T, обеспечивает штамму N. gonorrhoeae FA19 (дикий тип) относительно невысокое повышение МпК пенициллина, цефтриаксона и цефиксима (в 1,5, 1,5 и 3,5 раза соответственно). этот факт позволил предположить, что способность данных мутаций существенно повышать устойчивость N. gonorrhoeae к β-лактамным антибиотикам зависит от присутствия других мутаций в мозаичных аллелях penA. Авторами также было подтверждено значение мутации, приводящей к замене аминокислоты в положении 501 белковой цепи (A501v), которая до сих пор была обнаружена только в гене penA, не имеющем мозаичной структуры [35, 37, 38]. эксперимент по переносу мозаичного аллеля гена penA с мутацией, приводящей к замене аминокислоты в положении 501 белковой цепи (A501v), в изолят N. gonorrhoeae с хромосомно-обусловленной устойчивостью к пенициллину привел к повышению МпК цефтриаксона и цефиксима до пограничного уровня (0,4 и 1,2 г/мл соответственно). полученные результаты еще раз показали большую значимость возникновения данной мутации в гене penA N. gonorrhoeae, так как она является строго специфичной именно для N. gonorrhoeae и до сих пор не обнаружена у других представителей Neisseria spр. Скорее всего, данная мутация является результатом реакции микроорганизма на селективное давление, оказываемое цефалоспоринами — антимикробными препаратами широкого спектра действия. это предположение подтверждается и сообщениями S. Takahata и соавт. о спонтанном возникновении мутации A501v при проведении экспериментов по трансформации штаммов N. gonorrhoeae [36]. В исследованиях J. Tomberg и соавт. была обозначена еще одна мутация — N512Y, которая вносит вклад в снижение чувствительности гонококка к цефа-лоспоринам [10]. большинство исследователей считают, что значительную роль в развитии устойчивости N. gonorrhoeae к β-лактамам, в частности к цефало- ■ Вестник дерматологии и венерологии Обзор литературы А 47 споринам, играет инсерция Asp-345 [33—35]. Ее значение для снижения чувствительности N. gonorrhoeae к цефалоспоринам отмечается и в работе М. Ito и со-авт. [34]. Однако для оценки вклада того или иного изменения молекулярной структуры генов и белков в развитие устойчивости микроорганизма к антибиотику помимо аминокислотной последовательности важно знать пространственную структуру белка. Недавно группой ученых из США [39] была получена третичная структура белка РВР2. проведенное исследование было направлено на выяснение роли отдельных мутаций РВР2 в развитии устойчивости N. gonorrhoeae к пенициллину, однако полученные результаты и выводы вполне могут быть применены и при анализе механизмов развития резистентности N. gonorrhoeae к цефалоспоринам ввиду сходства молекул этих антибиотиков (рис. 1). В структуре РВР2 выделяют два домена: N-концевой (терминальный) и С-терминальный транспептидазный (или пенициллинсвязывающий) (рис. 2). Такая структура характерна для всех РВР белков. N-терминальный домен вытянут, имеет длину около 45 ангстрем и состоит из нескольких β-тяжей и субдомена, включающего короткие тяжи и небольшие спирали. функциональная роль этого домена остается неясной. Высказано предположение, что он может способствовать правильной ориентации каталитической части фермента от цитоплазматической мембраны к пептидогликановому субстрату, так как подобная функция описана для С-домена белка РВР5 E. coli [40]. Транспептидазный домен также может быть разделен на две составляющие его части: α- и α/β-субдомены с расположенным в углублении между ними активным центром фермента. Интересной особенностью этого фрагмента является выступающая β-складчатая структура, располагающаяся по ходу аминокислотной цепи между спиралями α2 и α4. В белках РВР2, выделенных из резистентных штаммов N. gonorrhoeae, в подавляющем большинстве случаев именно на этом участке обнаруживается инсер-ция аспаргиновой кислоты (Asp-345a) [41]. Мутации в С-терминальном домене, которые могут привести к снижению чувствительности N. gonorrhoeae к β-лактамам, должны располагаться на участках, формирующих активный центр, либо в непосредственной близости от него, чтобы иметь возможность влиять на архитектуру активного центра. С другой стороны, привнесенные изменения должны приводить к снижению реакционной способности фермента в отношении антибиотика, не нарушая при этом его нормальной функции, т. е. транспептидазной активности. Среди подобных мутаций в белковой цепи РВР2 авторы отмечают четыре основных: три из них — F504L, A510v и A516G — расположены в β4 или в разорванной петле между β4 и β3, еще одна — p551S — находится в спирали α11, которая лежит на С-конце белка (рис. 3). предполагается, что последняя мутация может играть важную роль в формировании устойчивости N. gonorrhoeae к пенициллину, так как по сравнению с РВР2 штамма N. gonorrhoeae дикого типа она в 3 раза снижает уровень ацилирования РВР2, в то время как аминокислотные замены F504L, A510v и A516G оказывают незначительное влияние (менее чем двукратное снижение ацилирования). Вместе с тем присутствие одновременно двух мутаций — F504L и p551S — снижает уровень ацилирования РВР2 почти таким же образом, что и четыре мутации одновременно. полученные результаты позволили предположить, что именно эти две мутации С-домена (F504L и p551S) вносят основной вклад в развитие устойчивости N. gonorrhoeae к пенициллину. Мутантный белок РВР2 имеет более низкую температуру плавления по сравнению с белком дикого типа, следовательно, мутации, связанные с устойчивостью N. gonorrhoeae к пенициллину, вносят в структуру белка некоторый дестабилизирующий эффект. B HH H С — N — С- С' /CH3 CH С — COOH H R2. ч У O OH A H H S R С O O С N N Рис. 1. Структурная организация молекул пенициллина (А), цефалоспорина (B) 48 к № 5, 2012 J Рис. 2. Структура РВР2 N. gonorrhoeae (цит. по: [39]) I Рис. 3. Расположение мутаций, связанных с устойчивостью к пенициллину, в структуре РВР2 [39]. Трехмерная структура транспептидазного домена РВР2, отражающая расположение мутаций вокруг активного центра фермента (содержит модель пенициллина в связанной форме). Мутации отмечены черными кружками ■ Вестник дерматологии и венерологии Обзор литературы А 49 Неожиданностью оказалось то, что четыре мутации в С-концевом домене РВР2, снижающие уровень ацилирования белка почти в 5 раз, оказывают лишь незначительное влияние на его архитектуру. это наблюдение можно объяснить двумя причинами: 1) мутации ведут к таким небольшим изменениям в структуре белка, что они не заметны на рентгенограмме, но вносят существенные изменения в кинетику, или 2) разные конформационные состояния фермента, имеющие разную ацилирующую активность, находятся в динамическом равновесии. Наличие мутаций смещает это равновесие в сторону дереактивации белка. Наблюдать эти состояния, используя метод кристаллографии, невозможно из-за того, что мутантный белок и белок дикого типа кристаллизуются только в одном, одинаковом конформационном состоянии. Расположение мутаций вблизи активного центра фермента, влияющих на изменение чувствительности микроорганизма к антибиотику, не является уникальным для белка РВР2 N. gonorrhoeae. Такое явление описано для ацетилхолинэстеразы Drosophila [42], протеазы HIv-1 [43], цитохрома Р450 Candida albicans [44] и некоторых других ферментов патогенных микроорганизмов. Таким образом можно предположить, что такое расположение мутаций является общей распространенной тенденцией при формировании устойчивости микроорганизмов к АМп. Интересной особенностью именно РВР2 N. gonorrhoeae оказалось то, что две аминокислотные замены располагаются на участке между β3 и β4 белковыми структурами, что подчеркивает важность этого региона. значение другой мутации — инсерции аспарагиновой кислоты в положении 345 аминокислотной последовательности — отмечается многими исследователями, поскольку она наиболее часто встречается в белках, выделенных из резистентных как к пенициллину, так и к цефалоспоринам штаммов N. gonorrhoeae [41]. Несмотря на то что эта мутация может снижать эффективность действия пенициллина (белка в отношении к пенициллину) более чем в 25 раз, в присутствии других мутаций ее эффективность резко снижается (снижение сродства к пенициллину только в 2 раза) [45]. Тот же эффект наблюдается для мутаций в С-терминальном домене. эти данные позволяют предположить, что эти два типа изменений — Asp-345a и С-терминальные мутации — антагонистичны друг другу. Мутации в С-терминальном домене РВР2 N. gonorrhoeae, обусловливающие устойчивость N. gonorrhoeae к пенициллину, оказывают незначительное влияние на структуру самого белка в отличие от механизмов, наблюдающихся у РВР2 S. pneumoniae, когда практически на всех уровнях организации белковой молекулы происходят серьезные перестройки [46]. подобный механизм, при котором отдельные мутации не влияют на основную функцию фермента, но оказывают существенное влияние на его взаимоотношения с АМп, может являться одним из путей эволюции антибиотикорезистентности патогенных микроорганизмов. присутствие мутации Asp-345a существенно влияет не только на активность фермента в отношении пенициллина, но и на структуру его молекулы. Такая инсерция не ведет к драматическим для белка и его основной функции последствиям потому, что введенная аминокислота замещает практически идентичную, которая находится в позиции 346 и восстанавливает все или почти все водородные связи, в которых та была задействована. Таким образом, не всякая инсерция может иметь место в данной позиции и баланс между развитием устойчивости к пенициллину и сохранением транспептидазной активности фермента весьма деликатен. Штаммы N. gonorrhoeae со сниженной чувствительностью к цефалоспоринам могут иметь полирези-стентный фенотип. почти всегда они проявляют устойчивость к пенициллинам, что вполне объяснимо, хотя могут быть нечувствительны и к другим группам антибиотиков [47]. появление полирезистентных штаммов N. gonorrhoeae связывают в основном с Азиатско-Тихоокеанским регионом, а точнее с японией. Так, в 2000 г. в японии был выделен штамм N. gonorrhoeae со сниженной чувствительностью к цефтриаксону [48]. Анализ чувствительности данного штамма к АМп показал, что он устойчив к действию пенициллина, тетрациклина, азитромицина и ципрофлоксацина. при этом в геноме штамма были обнаружены генетические детерминанты такой резистентности, т. е. мутации в генах penA, ponA, mtrR, penB, gyrA и parC. В 2001 г. четыре штамма N. gonorrhoeae, резистентные к пенициллину, тетрациклину и ципрофлоксаци-ну и при этом имеющие сниженную чувствительность к цефиксиму, были выделены и на Гавайских островах [49]. предполагается, что они могли быть занесены из японии, так как штаммы со сходным спектром анти-биотикорезистентности были получены там двумя годами ранее [18]. В 2011 г. в японии был выделен штамм N. gonorrhoeae (Н041) с самым высоким уровнем устойчивости к цефалоспоринам: МпК цефтриаксона составила 2—4 г/мл, что в 4—8 раз выше соответствующего показателя у штаммов, описанных ранее [19]. Выделенный штамм оказался устойчивым к различным β-лактамным антибиотикам, фторхинолонам, макролидам, тетрациклинам, триметоприм-сульфа-метоксазолину, хлорамфениколу и нитрофурантои-ну, однако диско-диффузионный метод определения чувствительности штамма N. gonorrhoeae к АМп выявил наличие его чувствительности к спектиномици-ну [50]. Штамму Н041 был присвоен новый NG-MAST сиквенс-тип (ST4220) и MLST сиквенс-тип (ST7363), были также генотипически охарактеризованы все основные детерминанты резистентности. Большинство 50 к № 5, 2012 мутаций в ключевых генах, ответственных за развитие антибиотикорезистентности (porB, penA, mtrR, penB, ponA1 (L421P), pilQ), были описаны у ранее выделенных штаммов N. gonorrhoeae со сниженной чувствительностью к цефалоспоринам, за исключением 12 аминокислотных замен в pbp2. Одна из этих мутаций (T486i) была обнаружена ранее в штаммах N. meningitidis и N. flavescens, а еще четыре — A311 v, v316p, L328T и T484S — были выявлены у Neisseria spр. впервые. Исходя из вышеизложенного можно сделать вывод о том, что в структуре РВР2 N. gonorrhoeae за устойчивость к пенициллину и цефалоспоринам отвечают изменения, возникающие на одних и тех же участках аминокислотной цепи. И хотя пока не ясно, какие конкретно мутации в гене, кодирующем данные участки, приводят к снижению чувствительности N. gonorrhoeae к цефалоспоринам, можно с высокой долей вероятности обозначить «ключевые места» в последовательности белка, изменения в которых могут иметь важное значение для развития резистентности N. gonorrhoeae к цефалоспоринам: это переход β3-структуры в β4, спирали а11 и а2, а также определенная как β2с-структура, несущая инсерцию Asp-345а. Все они окружают активный центр фермента и могут оказывать влияние на его архитектуру. В настоящее время не прекращаются исследования, направленные как на выявление штаммов N. gonorrhoeae со сниженной чувствительностью к це-фалоспоринам и анализ путей их распространения, так и на изучение молекулярных механизмов развития устойчивости к этой группе АМп. Можно надеяться, что в скором времени будут установлены локализация и характер ключевых мутаций, приводящих к развитию резистентности N. gonorrhoeae к цефалоспоринам, что позволит определить пути повышения эффективности антибиотикотерапии при лечении гонококковой инфекции.

About the authors

O S KOZHUSHNAYA

YE L VASILIYEVA

N V FRIGO

Email: frigo@cnikvi.ru

V S SOLOMKA

References

Supplementary files