Microbiological assessment of the effectiveness of standard therapy in atopic dermatitis

Full Text

Обоснование

Атопический дерматит — воспалительное заболевание кожи, характеризующееся рецидивирующим течением и интенсивным зудом. Индустриализация и высокие темпы урбанизации способствуют росту распространенности заболевания, которая достигает до 15–30% среди детей и до 10% среди взрослого населения повсеместно [1, 2]. При этом заболевание значительно ухудшает качество жизни пациента, препятствуя нормальному течению повседневной жизни и вызывая психоэмоциональный стресс [3].

Чаще всего атопический дерматит развивается в раннем детском возрасте и имеет широкий спектр клинических проявлений. Характер и локализация кожных проявлений меняются в зависимости от возраста. Как правило, у детей грудного возраста поражение кожи носит острый характер, нередко с явлениями экссудации, и наиболее выражено на лице, разгибательных поверхностях конечностей и ягодицах. Однако во взрослом возрасте кожный процесс приобретает хронический характер и может быть представлен различными морфологическими элементами: от папул и небольших локализованных бляшек до распространенных очагов лихенификации, сопровождающихся интенсивным зудом, и эритродермии в тяжелых случаях [4, 5].

Атопический дерматит представляет собой гетерогенное заболевание. На развитие заболевания влияет совокупность факторов, включающая генетическую предрасположенность, нарушение целостности кожного барьера, дефекты иммунной системы, а также воздействие окружающей среды [6].

В последние десятилетия появление новых методов идентификации бактерий позволяет проводить исследования на уровне видов и штаммов. Это, в свою очередь, способствует более детальному изучению влияния различных микроорганизмов на течение и степень тяжести различных заболеваний, в том числе атопического дерматита.

В норме условно-патогенные микроорганизмы кожного барьера участвуют в защите организма от проникновения патогенов, а также в поддержании баланса между про- и противовоспалительными реакциями иммунитета [7]. Большинство условно-патогенных бактерий, обнаруживаемых на коже здорового человека, относятся к четырем типам: Firmicutes (Staphylococcus, Streptococcus), Actinobacteria (Micrococcus, Cutibacterium, Brevibacterium, Corynebacterium, Propionibacterium, Actinomyces), Proteobacteria (Haematobacter, Paracoccus) и Bacteroidetes (Chryseobacterium, Prevotella, Porphyromonas) [8]. При этом Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis) является доминирующим грамположительным видом нормальной микробиоты кожи человека [9].

Обострения атопического дерматита ассоциированы с нарушением баланса микробиома кожи. У большинства пациентов происходит резкое снижение микробного разнообразия, сопровождаемое избыточной колонизацией кожи Staphylococcus, преимущественно Staphylococcus aureus (S. aureus) [7, 10].

В настоящее время подход к лечению атопического дерматита, согласно действующим клиническим рекомендациям, определяется степенью тяжести заболевания, а также наличием осложнений, например, присоединением вторичной инфекции [11]. Однако не всегда выбранная тактика лечения дает ожидаемые результаты, что может быть обусловлено не только изменениями со стороны различных звеньев иммунной системы, но и измененным составом микробного сообщества кожи. Следовательно, целесообразно исследование влияния терапии на микробиом кожи.

Цель исследования: изучить изменение бактериального состава микробиома на пораженных и видимо неизмененных участках кожи на фоне проведения комплексной терапии при атопическом дерматите.

Методы

Основная группа

В исследование были включены 20 пациентов с диагнозом «Атопический дерматит» («Другие атопические дерматиты» L20.8 по МКБ-10), находившихся на стационарном лечении в клинике кожных и венерических болезней им. Рахманова (Сеченовский университет). Критерием включения в исследование являлось:

• верифицированный диагноз «Атопический дерматит» в соответствии с международными диагностическими критериями Hanifin J. M. и Rajka G. [12];
• стадия болезни: стадия обострения или выраженных клинических проявлений;
• распространенность кожного процесса: распространенная или диффузная формы.

Для оценки степени тяжести заболевания был использован индекс SCORAD (SCORing Atopic Dermatitis), согласно которому значения SCORAD от 25 до 50 соответствуют средней, а значения SCORAD > 50 — тяжелой степени тяжести атопического дерматита [13]. Обязательным условием включения являлось отсутствие проведения системной и/или местной антибактериальной терапии в течение последнего месяца. Все пациенты получали комплексную терапию в соответствии с действующими клиническими рекомендациями «Атопический дерматит» (утверждены Минздравом РФ 26.08.2021) по ведению пациентов с данной патологией с учетом степени тяжести заболевания, включая системную антигистаминную и десенсибилизирующую терапию, местную (топические глюкокортикостеродные препараты и ингибиторы кальциневрина) и системную противовоспалительную терапию, а также узкополосную УФБ-терапию 311 нм [11].

Группа сравнения

Группа сравнения состояла из 26 добровольцев старше 18 лет, не имеющих в анамнезе аллергических заболеваний кожи и системных хронических воспалительных процессов.

Микробиологические методы

Для изучения микробиома кожи был использован метод посева на стерильные бакпечатки однократного применения с площадью рабочей поверхности 4,5 см² (Медполимер, Россия), проводимый по методическим рекомендациям «Определение кокковой и дрожжевой микрофлоры кожи у больных с кожной патологией» [14]. Предварительно бакпечатки были заполнены селективными средами: желточно-солевой агар (ЖСА) — для выделения стафилококков, и кровяной агар — для изоляции более требовательных к питательной среде микроорганизмов, таких как Neisseria и Streptococcus [14, 15].

После открытия бакпечатки стерильным пинцетом поверхность с питательной средой аккуратно, без дополнительного давления, прикладывалась к коже на 20 секунд. Взятие материала у больных атопическим дерматитом осуществлялось до и после терапии (на 14-й день), проводимой в условиях стационара, как на пораженных, так и на видимо неизмененных участках сгибательной поверхности верхних конечностей. Посев микроорганизмов с кожи условно здоровых людей был выполнен однократно с внутренней поверхности плеча.

Бакпечатки помещались в термостат при температуре +37 °С. Через 24–48 часов визуально оценивались вид и количество выросших колоний. Затем с каждой бакпечатки отбирались однотипные характерные колонии для посева на чашки Петри с ЖСА и кровяным агаром для получения чистых культур. Видовая идентификация клинических изолятов проводилась с использованием метода масс-спектрометрии на приборе MALDI Biotyper Sirius (Bruker Daltonics GmbH & Co. KG, Германия).

Хранение и статистическая обработка данных

Хранение и обработка данных осуществлялись с помощью электронной базы данных REDCap (Research Electronic Data Capture). Для проведения статистического анализа данных, а также для формирования таблиц использованы пакеты программ EXCEL 2003 и STATISTICA 7.0.

При проведении статистического анализа данных, полученных в группе исследования, признаки описывались с использованием абсолютной и относительной частоты их обнаружения. В группе исследования попарное сравнение значений признаков, измеренных до и после проведенного курса лечения, проводилось с использованием биномиального критерия, который оценивает достоверность различий в количестве пациентов с разным характером изменения (количество пациентов, у которых после лечения бактерии повторно не обнаружились или появились впервые). Пороговыми значениями для выявления статистически значимых различий или тенденций считались общепринятые уровни значимости 0,05 и 0,1 соответственно.

Результаты

По результатам исследования средний возраст пациентов с атопическим дерматитом варьировал от 18 до 58 лет. При этом средний возраст составил 31,85 года, с медианой — 31 год. В основной группе из 20 человек 75,0% были женщины (n = 15) и 25,0% — мужчины (n = 5). Согласно значению индекса SCORAD у 60,0% пациентов с атопическим дерматитом была выявлена средняя степень тяжести заболевания, у 40,0% — тяжелая степень.

При анализе всего спектра выделенных микроорганизмов были выделены 3 показателя, которые являются наиболее значимыми в патогенезе атопического дерматита: S. aureus, другие стафилококки и другие бактерии. На рис. 1 представлены результаты идентификации микроорганизмов методом масс-спектрометрии, отражающие частоту встречаемости микроорганизмов среди пациентов с изучаемой патологией и группы сравнения.

 

Рис. 1. Частота встречаемости микроорганизмов среди пациентов с атопическим дерматитом и группы сравнения (%)

 

На исходном уровне у пациентов с атопическим дерматитом доля S. aureus от всех выделенных бактерий в области очагов поражения составила 34,20% и на видимо неизмененных участках кожного покрова — 32,50%. После проведенной терапии численность S. aureus в очагах поражения уменьшилась в 1,6 раза (21,60%), в то время как на непораженных участках — в 2 раза (15,6%). Важно отметить, что S. aureus в группе сравнения не был обнаружен.

В приведенной таблице представлена динамика изучаемых показателей у пациентов с атопическим дерматитом до и после терапии (табл. 1). По результатам можно отметить достоверное снижение частоты обнаружения S. aureus на пораженных и непораженных участках кожи (р < 0,05). Для других стафилококков была выявлена тенденция к увеличению частоты встречаемости микроорганизмов данного рода бактерий (р < 0,1).

 

Таблица 1. Динамика показателей пациентов с атопическим дерматитом до и после лечения

Table 1. Changes in skin microbiome in patients with atopic dermatitis before and after treatment

Показатели	Количество пациентов, у которых до лечения бактерии были обнаружены	Количество пациентов, у которых после лечения бактерии повторно не обнаружились или появились	p-значения (биномиальный критерий)
Пораженные участки (n = 20)
S. aureus	15 (75%)	–9/2	0,046
Другие стафилококки	10 (50%)	–4/11	0,072
Другие бактерии	8 (40%)	–6/3	0,274
Неизмененные участки (n = 20)
S. aureus	12 (60%)	–7/0	0,02
Другие стафилококки	11 (55%)	–3/9	0,09
Другие бактерии	9 (45%)	–5/3	0,377

 

На следующем этапе проводился анализ распределения стафилококков по видам (рис. 2). В первый день стафилококковая составляющая микробиома кожи характеризовалась доминированием S. aureus как на пораженных, так и на неизмененных участках кожи: 53,6 и 48,0% соответственно. Через 14 дней от начала терапии частота выделения S. aureus в очагах поражения составила 28,6% и на видимо неизмененной коже — 20,8%.

 

Рис. 2. Видовой состав Staphylococcus spp., выделенных от пациентов с атопическим дерматитом на пораженных и видимо неизмененных участках кожного покрова (n = 20)

 

В первый день частота выделения других стафилококков на пораженных участках составила 46,4%, среди которых преобладали S. hominis — 14,3%, S. capitis — 10,7% и S. epidermidis — 10,7%. На видимо неизмененной коже на долю комменсальных стафилококков пришлось 46,4%, с преобладанием S. epidermidis — 16,0%, S. capitis — 12,0% и S. haemolyticus — 12,0%. На 14-й день удельный вес других стафилококков составил 71,4% на пораженных и 79,2% на неизмененных участках кожного покрова. При этом на измененных участках преобладал S. haemolyticus — 42,9%, а на неизмененных — S. epidermidis — 20,8% и S. haemolyticus — 20,8%.

Стафилококковая часть микробиома кожи группы сравнения была представлена 6 видами Staphylococcus (рис. 3). Среди выделенных стафилококков преобладали S. epidermidis — 35,5%, S. hominis — 29,0%, S. capitis — 19,4%.

 

Рис. 3. Видовой состав Staphylococcus spp., выделенных у группы сравнения (n = 26)

 

При распределении выделенных штаммов других бактерий по родам у пациентов с атопическим дерматитом были получены следующие результаты (рис. 4). На момент поступления на пораженных участках кожи преобладали бактерии рода Acinetobacter с удельным весом 40,0%. На видимо неизмененных участках кожи наиболее часто встречались бактерии рода Acinetobacter — 25,0%, Micrococcus — 25,0% и Pseudomonas — 16,7%.

 

Рис. 4. Видовой состав других бактерий, выделенных от пациентов с атопическим дерматитом на пораженных и видимо неизмененных участках кожного покрова (n = 20)

 

После проведенной терапии в очагах поражения частота встречаемости Acinetobacter spp. составила 33,3%, Micrococcus luteus — 22,2%, представители других родов бактерий встречались реже. На неизмененных участках кожи было выделено 3 рода бактерий: Acinetobacter, Micrococcus и Corynebacterium, удельный вес которых составил 37,5, 50,0 и 12,5% соответственно.

На рис. 5 представлены результаты по частоте выделения других бактерий в группе сравнения. Чаще всего встречались бактерии рода Acinetobacter, Cytobacillus и Micrococcus и в 2 раза реже — Enterococcus, Moraxella и Neisseria.

 

Рис. 5. Видовой состав других бактерий, выделенных у группы контроля (n = 26)

 

Следует отметить, что среди Acinetobacter spp., выделенных от пациентов с атопическим дерматитом, встречались Acinetobacter radioresistens, Acinetobacter towneri, Acinetobacter lwoffii, Acinetobacter schindleri, Acinetobacter ursingii и Acinetobacter variabilis, в то время как в группе сравнения был идентифицирован лишь Acinetobacter lwoffii.

Обсуждение

Микробиом кожи у здоровых людей находится в относительном балансе, который поддерживает нормальное состояние кожи. Однако во время обострений атопического дерматита наблюдается выраженный дисбаланс микробиома кожи, который выражается в существенном уменьшении микробного разнообразия и чрезмерной колонизации S. aureus. Так, по данным научной литературы, частота носительства S. aureus у пациентов с атопическим дерматитом варьирует от 30 до 100%, тогда как среди здоровых добровольцев составляет около 20% [16, 17].

На настоящий момент микробиом кожи считается ключевым звеном патогенеза атопического дерматита [17]. Повышенная колонизация S. aureus у больных атопическим дерматитом приводит к нарушению целостности эпидермального барьера за счет выделения экзотоксинов и энтеротоксинов, которые нарушают нормальную регуляцию дифференцировки кератиноцитов и активируют тучные клетки, приводя к развитию и/или поддержанию Th2-опосредованного иммунного ответа [10, 16, 19]. Следовательно, уменьшение доли S. aureus в процессе лечения способствует восстановлению как микробного состава кожи, так и целостности кожного барьера.

В ходе нашего исследования были получены результаты, подтверждающие наличие различий в микробном составе между пациентами с атопическим дерматитом и группой сравнения. До начала терапии доля S. aureus от всех выделенных микроорганизмов пациентов составила 34,20% на пораженных и 32,50% на неизмененных участках. По мере того как состояние кожи пациентов на фоне проводимой терапии восстанавливалось, отмечалось статистически достоверное снижение доли S. aureus на пораженных и видимо неизмененных участках (р < 0,05), а также смещение микробного состава кожи в сторону нормы, выражающееся в виде тенденции к увеличению частоты встречаемости других стафилококков (р < 0,1). При этом в группе сравнения S. aureus не был обнаружен.

Следует отметить, что коагулазонегативные стафилококки, включая S. epidermidis и S. hominis, выделяют противомикробные пептиды, которые, в свою очередь, ограничивают рост S. aureus и формирование биопленки [19]. Поэтому тенденция к увеличению доли других стафилококков на фоне терапии может свидетельствовать о восстановлении баланса между стафилококковой составляющей микробиома кожи.

Заключение

Полученные в ходе исследования результаты свидетельствуют о том, что проведение комплексной терапии в соответствии с клиническими рекомендациями способствует изменению микробного состава как на пораженных участках кожного покрова, так и вне очагов поражения. Дальнейшее изучение влияния терапии на микробиом кожи позволит не только оценить ее эффективность, но и разработать новые методы лечения, направленные непосредственно на коррекцию микробиома кожи, который является важным звеном в патогенезе атопического дерматита.

About the authors

Olga Yu. Olisova

Sechenov University

Email: olisovaolga@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2482-1754
SPIN-code: 2500-7989

MD, Dr. Sci. (Med.), Professor, Corresponding Member of the Russian Academy of Sciences

Россия, Moscow

Oxana A. Svitich

Sechenov University; I. I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: svitichoa@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1757-8389
SPIN-code: 8802-5569

MD, Dr. Sci. (Med.), Professor, Corresponding Member of the Russian Academy of Sciences

Россия, Moscow; Moscow

Alexander V. Poddubikov

I. I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: poddubikov@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8962-4765
SPIN-code: 9658-1553

MD, Cand. Sci. (Med.)

Россия, Moscow

Nune O. Vartanova

I. I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: labmicr@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6372-9910
SPIN-code: 6795-0835

Cand. Sci. (Biol.)

Россия, Moscow

Mariia B. Potapova

Sechenov University; I. I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Author for correspondence.
Email: ptpv.msh@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9647-1322

Postgraduate Student

Россия, Moscow; Moscow

References

Supplementary files