Experimental modeling of congenital epidermolysis bullosa — a tool for studying the pathogenesis and gene therapy targets of the disease

Full Text

Введение

Врожденный буллезный эпидермолиз (ВБЭ) – это фенотипически и генетически гетерогенная группа наследственных дерматозов, характеризующаяся образованием пузырей на коже и/или слизистых оболочках при минимальном механическом воздействии [1]. В настоящее время в 16 генах структурных белков кожи выявлено более 1000 мутаций, способных приводить к развитию различных клинических типов ВБЭ: простой буллезный эпидермолиз (ПБЭ), пограничный буллезный эпидермолиз (ПогрБЭ), дистрофический буллезный эпидермолиз (ДБЭ) и синдром Киндлера [2]. Каждый тип обусловлен мутациями в определённых генах, кодирующих белки, обеспечивающих интраэпидермальные или дермо-эпидермальные соединения. Например, мутации генов KRT5, KRT14, PLEC, KLHL24, DST, EXPH5 и CD151 вызывают ПБЭ; дефекты генов COL17A1, LAMA3, LAMB3, LAMC2, ITGA6, ITGB4 и ITGA3 – различные формы ПогрБЭ; мутации гена COL7A1 – ДБЭ; а FERMT1 – синдром Киндлера [3-7]. В связи с более глубоким уровнем поражения кожи при рецессивном дистрофическом буллезном эпидермолизе (РДБЭ) и ПогрБЭ возрастает риск присоединения вторичной инфекции, развития сепсиса, а также быстро метастазирующего плоскоклеточного рака кожи в области хронических кожных язв и/или на рубцах [2]. В 2016 году распространенность ВБЭ на территории 60 из 85 субъектов Российской Федерации составила 3,9 на миллион населения, заболеваемость - 0,33 на миллион населения, при этом отмечено преобладание больных ПБЭ и ДБЭ (48% и 24% соответственно) [8].

Изучение патогенеза и разработка терапевтических стратегий при ВБЭ сопряжены с существенными трудностями, обусловленными орфанным характером заболевания и этическими ограничениями, накладываемыми на проведение исследований с участием пациентов. В связи с этим экспериментальные модели ВБЭ на животных, в особенности с использованием лабораторных мышей, приобретают ключевое значение в современной науке. Данные модели позволяют репродуцировать специфические генетические дефекты (например, мутации в Col7a1, Krt14 и др.), лежащие в основе различных подтипов ВБЭ, имитировать патологические процессы, ассоциированные с нарушением целостности интраэпидермального и дермо-эпидермального соединения, а также обеспечивать платформу для доклинической оценки перспективных методов терапии в условиях in vivo. В данном обзоре представлены современные подходы к созданию моделей ВБЭ на животных (табл.1).

Простой буллезный эпидермолиз

ПБЭ характеризуется образованием пузырей в верхних слоях эпидермиса и является наиболее распространенным типом ВБЭ с аутосомно-доминантным наследованием [3, 9]. В 75% случаев он обусловлен миссенс-мутациями в генах KRT5 и KRT14 - белков из группы кератинов II типа, формирующих промежуточные филаменты и экспрессирующихся, в основном, в базальных кератиноцитах [3]. Мутация приводит к нарушению функции филаментов, но не вызывает их полной элиминации [10].  В исследовании Peters B. и соавт. (2001 г.) инактивация гена кератина 5 (Krt5) вызывает множественные эрозии у мышей и гибель в первые часы жизни из-за отсутствия кератиновых филаментов в базальном эпидермисе [11]. Lloyd C. и соавт. (1995 г.) определили, что нокаут гена кератина 14 (Krt14) позволяет сохранить часть цитоскелета за счет компенсаторной экспрессии кератина 15 (Krt15), хотя и приводит к распространенным эрозивным дефектам кожи и смерти вскоре после рождения [12]. Инактивация генов Krt5 и Krt14 у мышей ассоциирована с тотальной деструкцией эпидермиса и неонатальной летальностью, что подчеркивает фундаментальную роль KRT5 и KRT14 в обеспечении механической прочности эпидермиса [11-12]. Задолго до разработки нокаутных моделей, Vassar R. и соавт. (1991 г.) установили, что экспрессия мутантного гена Krt14 в эпидермисе мышей приводит к обширным кожным поражениям, как при ПБЭ у людей [13]. В дальнейшем Cao T. и соавт. (2001 г.) разработана линия мышей с индуцированной точечной мутацией в гене Krt14, проявляющейся заменой аргинина, кодируемого кодоном 131, на цистеин [14]. Данная мутация аналогична той, которая встречается у пациентов с ПБЭ [15]. Такая модель позволяет локально активировать мутантный аллель Krt14, приводит к появлению пузырей in vivo и воспроизводит фенотип ПБЭ в контролируемых условиях. Заживление пузырей происходит за счёт миграции неповреждённых стволовых клеток из прилегающих зон, тем самым объясняя мозаичность заживления у пациентов с ПБЭ. При активации мутантного аллеля во всей коже мыши погибали в течение первой недели из-за обширных очагов поражения. Исследование подчеркивает потенциальные возможности тестирования новых методов генной терапии ПБЭ на жизнеспособных моделях мышей [14]. Химерные РНК-ДНК олигонуклеотиды могут быть использованы для исправления точечной мутации в мутантном аллеле Krt14 посредством гомологичной рекомбинации и репарации несоответствий [16-17].

В редких случаях ПБЭ связан с мутациями в генах PLEC, KLHL24, DST, EXPH5 и CD151 [4]. Описано, что в 8% ПБЭ ассоциирован с мутациями гена, экспрессирующего плектин (PLEC), который является ключевым компонентом промежуточных филаментов, обеспечивает механическую прочность и стабильность клеток, особенно в эпидермисе и мышечной ткани [18]. В работе Andrä K. и соавт. (1997 г.) нокаут Plec у мышей приводит к образованию множественных быстро вскрывающихся пузырей в базальном слое эпидермиса, прогрессирующей мышечной дистрофии, сердечной недостаточности и последующему летальному исходу на 2-3 день после рождения [19]. Позже Ackerl R. и соавт. (2007 г.) создали модели мышей с мозаичной схемой делеции Plec, ограниченной кожей. Такие животные оказались жизнеспособными, а клиническая картина соответствовала очаговому характеру поражения кожи при ПБЭ у людей. Данная модель позволяет понять фенотипические проявления дефицита плектина в многослойном эпителии, а также проанализировать его функцию в других тканях, поражающихся при ПБЭ, таких как скелетные мышцы и мозг, что может быть использовано в качестве тест-систем для разработки новых методов терапии заболевания [20].

Пограничный буллезный эпидермолиз

ПогрБЭ — это тип ВБЭ, характеризующийся образованием пузырей и эрозий на коже и слизистых оболочках на уровне светлой пластинки (lamina lucida) базальной мембраны [21]. Развитие ПогрБЭ связано с мутациями семи генов — COL17A1, LAMA3, LAMB3, LAMC2, ITGA6, ITGB4 и ITGA3, кодирующих соответственно коллаген XVII типа, α3-, β3- и γ2-цепи ламинина-332, α6-, β4- и α3-субъединицы интегрина [5, 22-23]. Для заболевания характерен аутосомно-рецессивный тип наследования болезни, при котором манифестация болезни происходит в случае носительства мутаций на обоих аллелях соответствующего гена [22]. Аутосомно-доминантное наследование ПогрБЭ регистрируется крайне редко [24]. К двум основным субтипам относят тяжелый ПогрБЭ (ранее — тяжелый генерализованный ПогрБЭ Герлица) и ПогрБЭ средней тяжести (ранее — генерализованный ПогрБЭ средней тяжести не-Герлица) [22]. Тяжелый ПогрБЭ связан с полным отсутствием ламинина-332 - мультидоменного белка из семейства белков ламининов, функцией которых является поддержание адгезии эпителия и эндотелия на подлежащих тканях, а также передача сигналов, регулирующих миграцию и пролиферацию клеток, сохранение жизнеспособности и дифференцировку стволовых клеток, поэтому  часто приводит к летальному исходу в первые месяцы и годы жизни больного [4]. В исследовании Ryan M. и соавт. (1999 г.) описали, что нокаут Lama3 ассоциирован с появлением множественных пузырей и эрозивных дефектов у мышей и высоким уровнем неонатальной смертности [25]. Meng X. и соавт. (2003 г.) отметили, что инактивация гена Lamc2 путем направленной делеции экзона 8 со сдвигом рамки считывания приводит к обширным поражениям кожи на 1-2 день жизни мышей и гибели в течение 5 дней после рождения [26]. Kuster J. и соавт. (1997 г.) обнаружили, что спонтанная вставка intracisternal-A particle (IAP) на стыке экзона и интрона в ген Lamb3 вызывает у мышей нарушение структуры полудесмосом, образование множественных пузырей и эрозий на коже и слизистых оболочках с последующим летальным исходом [27]. В связи с тяжелым течением заболевания модели с мутациями в генах Lama3, Lamb3, Lamc2 были нежизнеспособными, что затрудняло их использование в исследованиях [25-27]. Bubier J. и соавт. (2010 г.) выявили спонтанную мутацию, которая не полностью отключает ген, а лишь снижает уровень γ2-цепи ламинина-332, что помогло в создании моделей мышей, совместимых с жизнью. Гомозиготные мыши рождались живыми со стремительным развитием прогрессирующего пузырно-эрозивного поражения кожи и слизистых, очень похожего на ПогрБЭ средней тяжести у человека. Такие мыши страдали хроническими незаживающими ранами, деформацией когтей, также у них были отмечены внекожные проявления: остеопения (снижение минеральной плотности костей), нарушение роста зубов и дыхательная недостаточность [28]. В исследовании Mavilio F. и соавт. (2006 г.) эпидермальные стволовые клетки, выделенные из биоптата кожи взрослого пациента, были модифицированы с использованием ретровирусного вектора, экспрессирующего комплементарную ДНК гена LAMB3. На следующем этапе генетически скорректированные клетки использовали для создания культивируемых эпидермальных трансплантатов in vitro. Девять таких лоскутов были имплантированы на предварительно подготовленные раневые поверхности нижних конечностей пациента. Полная приживаемость трансплантатов зафиксирована в течение 8 суток после процедуры [29]. Жизнеспособная модель, описанная в работе Bubier J. и соавт. (2010 г.), представляет собой важный доклинический инструмент, который как раз может быть использован для оценки эффективности и безопасности генной терапии перед переходом к клиническим исследованиям  у пациентов [28-29].

Capt A. и соавт. (2005 г.) сообщили, что рецессивные мутации в генах Lama3 и Lamb3 приводят к ПогрБЭ у немецких пойнтеров - породистых собак [30]. Данная модель подходит для оценки новых разрабатываемых методов генной терапии, основанных на доставке рекомбинантной цепи α3-цепи ламинина-332 и/или стратегий сплайсинга генов, а также представляет возможность в исследовании толерантности к трансплантации стволовых клеток кератиноцитов, экспрессирующих β3- и γ2-цепи ламинина-332 с мутированными эпитопами [30-31]. Spirito и соавт. (2002 г.) описали первую «большую» животную модель с тяжелым ПогрБЭ – у бельгийских жеребят быстро вскрывающиеся пузыри с формированием эрозий вызваны мутацией (гомозиготной вставкой пары оснований - 1368insC) в гене Lamc2, который по аминокислотной последовательности и строению цепи практически идентичен человеческому [32]. Данные модели стали подтверждением важной роли ламинина-332 в обеспечении прочности дермо-эпидермального соединения, и могут быть использованы в качестве тестирования новых методов генной терапии in vivo [30, 32].

ПогрБЭ с атрезией пилорического отдела желудка вызван в основном мутациями генов ITGA6 и ITGB4, экспрессия которых обнаруживается в различных участках эпителия — в коже, слизистых оболочках мочевыводящих путей и желудочно-кишечного тракта [33-34].  В исследовании Georges-Labouesse E. и соавт. (1996 г.) описано, что отсутствие α6-субъединицы интегрина у мышей приводит к нарушению структуры полудесмомом, появлению на коже множественных пузырей, эрозий и смерти сразу после рождения [35]. Почти одновременно van der Neut R. и др. (1996 г.) независимым путем вывели линию мышей без β4-субъединицы интегрина. Отсутствие полудесмосом приводило к повсеместной отслойке эпидермиса и высокой летальности [36]. Данные работы подтверждают важную роль α6β4-интегрина в прикреплении эпидермиса к базальной мембране, при отсутствии которого у моделей наблюдается клиническая картина, аналогичная тяжелому ПогрБЭ [35-36]. В дальнейших исследованиях предпринимались попытки смягчить фенотип: например, Raymond K. и соавт. (2005 г.) получили условно-нокаутных мышей по β4-субъединице интегрина (выключение гена в коже осуществлялось только после определенного возраста), что позволило избежать неонатальной смерти и изучить влияние потери полудесмосом на развитие заболевания [37]. У пациентов гомозиготная нонсенс-мутация в гене ITGA3 приводит к появлению быстро вскрывающихся пузырей на коже, развитию врожденного нефротического синдрома, интерстициальной болезни легких, чем  определяет летальный исход заболевания в младенчестве или раннем детском возрасте [38]. Случаи с миссенс-мутациями характеризуются более легким течением, выживанием до позднего детства или зрелого возраста [39-40]. В исследовании DiPersio C. и соавт. (1997 г.) описали, что выключение гена, кодирующего α3-субъединицу интегрина, к 15,5 дню эмбрионального развития мышей вызывало структурные дефекты базальной мембраны, включая прерывистое распределение ламинина-332 и коллагена IV типа, способствовало появлению и быстрому распространению субэпидермальных пузырей в коже и летальному исходу вскоре после рождения. Таким образом, авторы определили важную роль α3β1-интегрина в формировании структурной целостности базальной мембраны кожи и обеспечении адгезии эпидермиса к дерме [41].

Мутации гена коллагена XVII типа (COL17A1) обычно ассоциированы с развитием ПогрБЭ средней тяжести [42]. Коллаген XVII типа (также известный как 180 кДа антиген буллезного пемфигоида, BP180 и BPAG2) является основным структурным компонентом полудесмосом — высокоспециализированного мультибелкового комплекса, который обеспечивает крепление базальных эпителиальных клеток к подлежащей базальной мембране в многослойном, псевдомногослойном и переходном эпителии. Помимо участия в формировании полудесмосом коллаген XVII типа регулирует дифференцировку амелобластов и тем самым участвует в развитии зубов [43-45]. В работе Katoh Y. и соавт. (2024 г.) описали модели крыс с ПогрБЭ, который вызван мутацией в гене Col17a1. Несмотря на то, что у гомозиготных крыс, у которых полностью отсутствовал коллаген XVII типа, при рождении кожа выглядела почти нормальной, в течение первого дня жизни возникали множественные пузыри по всему телу, приводящие к гибели детенышей​. С помощью электронной микроскопии выявлено отсутствие составных частей полудесмосом - BP230 и плектина, хотя экспрессия мРНК этих молекул, по крайней мере, во время фетального периода, не была нарушена [46]. Как и в ранее проводимых исследованиях на моделях мышей, так и в данной работе показано, что коллаген XVII типа не так важен для развития кожи в пренатальный период, но критически необходим для поддержания стабильности дермо-эпидермальных связей после рождения, и может быть использована для дальнейшего тестирования терапевтических подходов, включая генетическую коррекцию мутаций Col17a1 [46-47].

Дистрофический буллезный эпидермолиз

ДБЭ — это тип буллезного эпидермолиза, характеризующийся образованием пузырей в верхней части дермы, ниже темной пластинки (lamina densa) базальной мембраны. Все подтипы ДБЭ обусловлены мутациями в гене COL7A1 на хромосоме 3p21.31, кодирующем альфа-1 цепь коллагена VII типа - основного белка якорных фибрилл, структуры, участвующей в прикреплении эпидермиса к подлежащей дерме. В зависимости от типа наследования выделяют аутосомно-доминантный и аутосомно-рецессивный ДБЭ [48-49]. Часто встречающимися клиническими формами заболевания считаются тяжелый рецессивный ДБЭ, рецессивный ДБЭ средней тяжести, доминантный ДБЭ средней тяжести и локализованный доминантный ДБЭ [50]. Наиболее тяжелое течение характерно для заболеваний с рецессивным типом наследования, обусловленных полным отсутствием или значительным уменьшением экспрессии коллагена VII типа в коже и слизистых оболочках [51-53]. Помимо кожи происходит поражение внутренних органов, включая желудочно-кишечный тракт, мочеполовые пути, почки и сердце [54-55]. В литературе описан ряд моделей – от полных нокаутов до гипоморфных аллельных вариаций Col7a1, отражающих весь спектр разнообразия и тяжести заболевания [56-57].    

Heinonen S. и соавт. (1999 г.) описали животную модель, полученную путем целенаправленной гомологичной рекомбинации. Нацеливающий вектор заменил экзоны 46-69 Col7a1 геном устойчивости к неомицину в ориентации обратной транскрипции, что привело к элиминации большей части альфа-1 цепи коллагена VII типа. Гетерозиготные (+/-) мыши Col7a1 были фенотипически нормальными. При скрещивании мышей Col7a1 (+/-) у потомства с генотипом Col7a1 (-/-) наблюдалась полная потеря якорных фибрилл во время рождения, появление множественных субэпидермальных пузырей на коже, что приводило к смерти мышей в течение 1–2 недель жизни, полностью имитируя картину тяжелого рецессивного ДБЭ у человека. Данная модель может быть использована для изучения патогенеза ДБЭ и тестирования генной терапии [56]. Позже Fritsch A. и соавт. (2008 г.) удалось создать модели с гипоморфными аллелями Col7a1– с пониженным, но не нулевым уровнем коллагена VII типа. Мыши, экспрессирующие около 10% нормального уровня коллагена VII​ типа, были жизнеспособны, но демонстрировали тяжелое течение заболевание кожи с самого рождения: множественные пузыри на слизистых и коже, ониходистрофию, заживление хронических ран с формированием контрактур и псевдосиндактилий​. Данная модель впервые воспроизвела прогрессирующее рубцевание при рецессивном ДБЭ, а также подтвердила склонность к развитию опухолей - у пожилых мышей с гипоморфными аллелями Col7a1 наблюдались предраковые изменения, как и у пациентов с РДБЭ, у которых к 30–40 годам часто возникает плоскоклеточный рак кожи. Внутрикожное введение фибробластов у мышей приводило к функциональному восстановлению дермально-эпидермального соединения и сопровождалось устойчивостью обработанных участков к фрикционному стрессу, в то время как необработанные участки демонстрировали разделение слоев кожи при таком же воздействии [57]. В другом исследовании Hong S. и соавт. (2022 г.) обнаружили, что перенос отредактированных кожных эквивалентов (кератиноцитов и фибробластов) с использованием прайм-редакторов ex vivo, полученных от пациента с рецессивным ДБЭ, на кожу иммунодефицитных мышей приводит к отложению коллагена VII типа и закреплению фибрилл в дермально-эпидермальном соединении [58]. Жизнеспособная модель, описанная в работе Fritsch A. и соавт. (2008 г.), представляет собой важный доклинический инструмент, который может быть использован для оценки эффективности и безопасности новых методов терапии, в том числе генной, перед переходом к клиническим испытаниям на больных [57-58].

Takaki S. и соавт. (2022 г.) создали животную модель рецессивного ДБЭ, содержащую мутации с использованием технологии редактирования генома i-GONAD, основанной на CRISPR. Наиболее часто встречающиеся в группах японских пациентов две мутации Col7a1, c.5818delC и E2857X, были введены в геном мышей. Гомозиготы по мутации с.5818delC умирали сразу после рождения, в то время как у гомозигот по мутации E2857X продолжительность жизни не сокращалась. У взрослых гомозиготных мышей E2857X наблюдались аномалии роста волос, синдактилия и дистрофия ногтей, что подтверждает патогенность данной мутации. Мыши со сложной гетерозиготной мутацией c.5818delC/E2857X представляли промежуточный фенотип между гомозиготными мышами c.5818delC и E2857X с нарушением в регуляции клеточного цикла интрафолликулярных кератиноцитов. Предлагаемая стратегия получения сложных гетерозиготных мышей в дополнение к существующей линии мышей перспективна для изучения патогенеза рецессивного ДБЭ и дальнейшей разработки новых методов терапии [59]. Alipour F. и соавт. (2022 г.) также описали использование технологии CRISPR/Cas9 при разработке иммортализованных клеточных линий кератиноцитов с дефицитом COL7A1, предназначенных для использования в качестве клеточной модели рецессивного ДБЭ в исследованиях ex vivo [60]. Несмотря на то, что коррекция гена COL7A1 ex vivo путем редактирования генов в клетках пациентов была достигнута не в одном исследовании [58-60], для непосредственного лечения пузырей при рецессивном ДБЭ необходимы методы редактирования in vivo. García M. и соавт. (2022 г.) создали аденовирусные векторы для доставки CRISPR-Cas9 с целью удаления экзона 80 гена COL7A1, который содержит мутацию, вызывающую сдвиг рамки. Для тестирования in vivo была использована модель мыши с гуманизированной кожей. Эффективная вирусная трансдукция кожи наблюдалась после того, как эксцизионные раны, образованные хирургическим перфоратором на регенерированных кожных лоскутах пациента, были заполнены аденовирусными векторами, помещенными в фибриновый гель. Отложение коллагена VII типа в зоне базальной мембраны поврежденных участков, обработанных векторами, коррелировало с восстановлением дермально-эпидермальной адгезии, демонстрируя, что поражения кожи пациентов с рецессивным ДБЭ можно лечить непосредственно с помощью доставки CRISPR-Cas9 in vivo [61]. В исследовании Webber B. и соавт. (2017 г.) объединили кластеризованные короткие палиндромные повторы с регулярными промежутками и ассоциированную с ними систему нуклеазы (CRISPR/Cas9) с микроинъекцией в эмбрионы NOD/SCID IL2rycnull (NSG) для быстрого создания иммунодефицитной Col7a1(−/−) модели рецессивного ДБЭ на мышах. Благодаря оптимизации дозы Webber B. и соавт. достигли эффективности биаллельного нокаута F0, превышающей 80%, что позволило получать большое количество мышей за короткий промежуток времени. В исследовании также обнаружена способность недавно идентифицированных кожных резидентных иммуномодулирующих мезенхимальных стволовых клеток, маркированных ABCB5, уменьшать тяжесть рецессивного ДБЭ и значительно продлевать продолжительность жизни мышей. Данная модель мышей является ценным инструментом для изучения механизмов заболевания и тестирования новых терапевтических подходов, включая клеточные и генные методы терапии [62].

В исследовании Stone W. и соавт. (2024 г.) описана новая модель рецессивного ДБЭ у крыс, которая имеет преимущества над созданными ранее моделями мышей (большая площадь поверхности, легкий уход). У крыс в гене Col7a1 была индуцирована делеция из 8 пар оснований, которая вызывает преждевременное изменение стоп-кодона ниже по потоку. У гомозиготных мутантов в постнатальном периоде были обнаружены пузыри, дальнейший гистологический анализ выявил субэпидермальные трещины и отсутствие фиксирующих фибрилл. Данная модель играет важную роль для тестирования новых методов терапии ВБЭ [63].

Заболевания с доминантным типом наследования вызваны в основном миссенс-мутациями гена COL7A1, приводящими к нарушению структуры коллагена VII типа, но не полному его отсутствию, поэтому протекают обычно легче [64]. В исследовании Nyström A. и соавт. (2013 г.) описали, что спонтанная мутация в гене Col7a1, вызывающая замену глицина на аспарагиновую кислоту (p.G1867D), аналогичная одной из человеческих, и вызывающая дестабилизацию фибрилл, способствует формированию первой жизнеспособной модели доминантного ДБЭ у крыс. Впервые показан эффект дозы гена: гомозиготные носители мутации страдают более тяжело, чем гетерозиготные. Модель повторяет все признаки заболевания человека - хрупкость эпителиальных структур кожи, склонность к образованию пузырей и формированию рубцов, ониходистрофия, и представляет перспективы для дальнейшего изучения молекулярных механизмов болезни, роли модифицирующих генов и разработки новых методов терапии для пациентов с доминантным ДБЭ, таких как глушение генов, химически индуцированное считывание экзонов или модуляция сплайсов [65-67]. В рамках исследования Smith B. и соавт. (2021 г.) выделены две наиболее распространенные мутации гена COL7A1 (p.G2034R и p.G2043R). Используя технологию CRISPR-Cas9, данные мутации были введены в ген Col7a1 (p.G2028R и p.G2037R). Полученные гетерозиготные модели мышей демонстрируют фенотип, сходный с клиническими проявлениями доминантного ДБЭ у людей, включая рецидивирующее образование пузырей и сниженную термостабильность коллагена VII типа. Данные модели оказались жизнеспособными, тем самым представляя возможности для проведения исследований в условиях, близких к хроническому течению доминантного ДБЭ у человека [68].

Синдром Киндлера

Синдром Киндлера (СК) представляет собой редкую форму ВБЭ с аутосомно-рецессивным типом наследования, обусловленную мутациями в гене FERMT1 (KIND1), кодирующем белок kindlin-1, который играет важную роль в адгезии и экспрессируется преимущественно в базальных кератиноцитах кожи, тканях пародонта и толстой кишки [7, 69]. Клинические проявления СК развиваются с рождения и включают в себя образование пузырей на коже и слизистых оболочках, последующее рубцевание с формированием рубцовых деформаций, контрактур, псевдосиндактилий, микростомии и анкилоглоссии, прогрессирующую пойкилодермию, фоточувствительность, стенозирующие процессы желудочно-кишечного и урогенитального тракта, ониходистрофию, эктропион нижних век, ладонно-подошвенная кератодермию, псевдоаингум, лейкокератоз губ, нарушение потоотделения и скелетные аномалии. Во взрослом возрасте у пациентов с СК повышается риск развития плоскоклеточного рака кожи и слизистых оболочек [69-73]. Zhang X. и соавт. (2017 г.)  создали кожные трансплантаты из кератиноцитов человека с дефицитом KIND1 и контрольных клеток, которые затем имплантировали на иммунодефицитных мышей, и выявили, что это повышает чувствительность кератиноцитов к повреждению ДНК и воспалительным реакциям, вызванным ультрафиолетовым (УФ) излучением, тем самым объясняя механизм фоточувствительности при синдроме Киндлера [74]. Rognoni E. и соавт. (2014 г.) описали мышей с нокаутом kind1, клиническая картина которых воспроизводит симптомы синдрома Киндлера у людей. Нокаут kind1 приводит к увеличению и гиперактивности стволовых клеток, а это, в свою очередь, к утолщению эпидермиса, развитию эктопических волосяных фолликулов и повышенной восприимчивости к кожным опухолям. Авторы отметили, что kindlin-1 играет важную роль в интеграции сигналов от интегринов и других рецепторов, влияя таким образом на адгезию клеток и сигнальные пути [75]. Использованием моделей мышей помогает в исследовании данных механизмов более детально [74-75].

 Обсуждение

Рассмотренные в настоящем обзоре экспериментальные модели ВБЭ на животных позволили существенно продвинуться в понимании молекулярных механизмов патогенеза различных форм заболевания. Генетически модифицированные линии, воспроизводящие ключевые мутации в соответствующих генах (Krt5, Krt14, Plec, Lama3, Lamb3, Lamc2, Col7a1 и др.), успешно имитируют фенотипические проявления, характерные для ВБЭ, и позволяют исследовать как ранние, так и поздние этапы развития патологического процесса.

Особое значение имеют модели, воспроизводящие доминантные формы ВБЭ, такие как ПБЭ, поскольку они характеризуются относительно лёгким течением, отсутствием выраженных нарушений роста и высокой выживаемостью животных. Это создаёт уникальные условия для длительных доклинических исследований, тестирования новых терапевтических подходов, включая генные и клеточные технологии, а также для изучения механизмов спонтанного заживления и мозаичности поражений [14-17, 20].

В то же время, модели тяжёлых рецессивных форм ВБЭ (ПогрБЭ, ДБЭ), несмотря на их высокую клиническую релевантность, часто сопровождаются неонатальной летальностью, что существенно ограничивает их применение в длительных исследованиях и требует разработки новых стратегий по смягчению фенотипа или созданию условных нокаутов [25-58].

Моделирование ВБЭ на лабораторных животных, прежде всего на мышах, позволяет изучать молекулярные основы заболевания и инициировать разработку новых эффективных методов лечения. Появление редактирования генома с помощью CRISPR-Cas9 [59-62], позволяющее вносить целевые мутации — как делеции, так и точечные мутации — в интересующие гены, упростило процесс моделирования заболевания.

Заключение

Экспериментальные модели ВБЭ на животных, в первую очередь на мышах, являются незаменимым инструментом для изучения патогенеза и доклинической оценки новых методов терапии данного орфанного заболевания. Создание и совершенствование животных моделей, отражающих как лёгкие, так и тяжёлые формы ВБЭ, позволило существенно расширить представления о роли структурных белков в обеспечении целостности кожного покрова, а также выявить ключевые мишени для генной и клеточной терапии. Дальнейшее совершенствование моделей необходимо для эффективной трансляции экспериментальных данных в клиническую практику.

 

 

 

Таблицы

 

Авторы, год	Тип врожденного буллезного эпидермолиза (БЭ)	Модель врожденного буллезного эпидермолиза	Выживаемость	Перспективы в применении
Peters B. и соавт. (2001 г.)	Простой БЭ	Мышь, нокаут Krt5	Гибель в первые часы жизни	-
Lloyd C. и соавт. (1995 г.)	Простой БЭ	Мышь, нокаут Krt14	Гибель в первые часы жизни	-
Vassar R. и соавт. (1991 г.), Cole-Strauss A. и соавт. (1996 г.), Alexeev V. и соавт.   (2000 г.).	Простой БЭ	Мышь, мутация в гене Krt14, проявляющейся заменой аргинина, кодируемого кодоном 131, на цистеин	Жизнеспособная модель – при активации мутантного аллеля на определенных участках кожного покрова, гибель в первую неделю жизни -при активации мутантного аллеля во всей коже	Тестирования новых методов генной терапии ПБЭ in vivo, химерные РНК-ДНК олигонуклеотиды могут быть использованы для исправления точечной мутации в мутантном аллеле Krt14 посредством гомологичной рекомбинации и репарации несоответствий
Andrä K. и соавт. (1997 г.)	Простой БЭ	Мышь, нокаут Plec	Летальный исход на 2-3 день после рождения	-
Ackerl R. и соавт. (2007 г.)	Простой БЭ	Мышь, мозаичная схема делеции Plec	Жизнеспособная модель	Позволяет понять фенотипические проявления дефицита плектина в многослойном эпителии, а также проанализировать функцию плектина в других тканях, поражающихся при ПБЭ, таких как скелетные мышцы и мозг, что может быть использовано в качестве тест-систем для разработки новых методов терапии заболевания
Ryan M. и соавт. (1999 г.)	Пограничный БЭ	Мышь, нокаут Lama3	Неонатальная смертность	-
Meng X. и соавт. (2003 г.)	Пограничный БЭ	Мышь, нокаут Lamc2	Гибель в течение 5 дней после рождения	-
Kuster J. и соавт. (1997 г.)	Пограничный БЭ	Мышь, мутация в гене Lamb3 (спонтанная вставка intracisternal-A particle (IAP) на стыке экзона и интрона)	Гибель в течение 24 часов после рождения	-
Bubier J. и соавт. (2010 г.), Mavilio F. и соавт. (2006 г.)	Пограничный БЭ	Мышь, мутация в гене Lamc2	Жизнеспособная модель	Может быть использована для доклинической оценки эффективности и безопасности генной терапии (эпидермальные стволовые клетки, модифицированые с использованием ретровирусного вектора, экспрессирующего комплементарную ДНК гена LAMB3) перед переходом к клиническим испытаниям на пациентах
Capt A. и соавт. (2005 г.), Capt A. и соавт. (2003 г.)	Пограничный БЭ	Немецкий пойнтер, мутация в генах Lama3 и Lamb3	Жизнеспособная модель	Подтверждение важной роли ламинина-332 в обеспечении прочности дермо-эпидермального соединения; подходит для оценки новых разрабатываемых методов генной терапии, основанных на доставке рекомбинантной цепи α3-цепи ламинина-332 и/или стратегий сплайсинга генов, а также представляет возможность в исследовании толерантности к трансплантации стволовых клеток кератиноцитов, экспрессирующих β3- и γ2-цепи ламинина-332 с мутированными эпитопами
Spirito и соавт. (2002 г.)	Пограничный БЭ	Бельгийский жеребенок, мутация (гомозиготная вставка пары оснований - 1368insC) в гене Lamc2	Жизнеспособная модель	Подтверждение важной роли ламинина-332 в обеспечении прочности дермо-эпидермального соединения, может быть использована в качестве тестирования новых методов генной терапии in vivo
Georges-Labouesse E. и соавт. (1996 г.)	Пограничный БЭ	Мышь, нокаут Itga6	Гибель сразу после рождения	-
van der Neut R. и др. (1996 г.)	Пограничный БЭ	Мышь, нокаут Itgb4	Летальный исход на 2-3 день после рождения	-
Raymond K. и соавт. (2005 г.)	Пограничный БЭ	Мышь, нокаут Itgb4 (Условно-нокаутная модель - выключение гена в коже осуществлялось только после определенного возраста)	Жизнеспособная модель	Позволяет изучить влияние потери полудесмосом на развитие заболевания
DiPersio C. и соавт. (1997 г.)	Пограничный БЭ	Мышь, нокаут гена, кодирующего α3-субъединицу α3β1-интегрина	Гибель сразу после рождения	-
Katoh Y. и соавт. (2024 г.)	Пограничный БЭ	Крыса, мутация в гене Col17a1	Гибель в течение первых нескольких дней или недель после рождения	Может быть использовано для тестирования терапевтических подходов, включая генетическую коррекцию мутаций Col17a1
Heinonen S. и соавт. (1999 г.)	Дистрофический БЭ	Мышь, нокаут Col7a1	Гибель в течение 1–2 недель жизни​	Может быть использована для изучения патогенеза ДБЭ и тестирования генной терапии
Takaki S. и соавт. (2022 г.)	Дистрофический БЭ	Мышь, мутации c.5818delC и E2857X в Col7a1	Гомозиготы по мутации с.5818delC – гибель сразу после рождения, гомозиготы по мутации E2857X – жизнеспособная модель, мыши со сложной гетерозиготной мутацией c.5818delC/E2857X – жизнеспособная модель	Предлагаемая стратегия получения сложных гетерозиготных мышей в дополнение к существующей линии мышей перспективна для изучения патогенеза рецессивного ДБЭ и дальнейшей разработки новых методов терапии
Fritsch A. и соавт. (2008 г.), Hong S. и соавт. (2022 г.)	Дистрофический БЭ	Мышь с гипоморфными аллелями Col7a1	Жизнеспособная модель	Может быть использована для оценки эффективности и безопасности новых методов терапии, в том числе генной, перед переходом к клиническим испытаниям на пациентах
García M. и соавт. (2022 г.)	Дистрофический БЭ	Мышь с гуманизированной кожей	Жизнеспособная модель	Может быть использована для исследования лечения БЭ с помощью доставки CRISPR-Cas9 in vivo
Webber B. и соавт. (2017 г.)	Дистрофический БЭ	Мышь, нокаут Col7a1 с помощью технологии CRISPR/Cas9	Жизнеспособная иммунодефицитная модель	Является ценным инструментом для изучения механизмов заболевания и тестирования новых терапевтических подходов, включая клеточные и генные методы терапии
Nyström A. и соавт. (2013 г.)	Дистрофический БЭ	Крыса, мутация в гене Col7a1, вызывающая замену глицина на аспарагиновую кислоту (p.G1867D)	Жизнеспособная модель	Повторяет все признаки человеческого заболевания и представляет перспективы для дальнейшего изучения молекулярных механизмов болезни, роли модифицирующих генов и разработки новых методов терапии, таких как таких как глушение генов, химически индуцированное считывание экзонов или модуляция сплайсов
Smith B. и соавт. (2021 г.)	Дистрофический БЭ	Мышь, мутации гена COL7A1 (p.G2034R и p.G2043R)	Жизнеспособная модель	Представляет возможности для проведения исследований в условиях, близких к хроническому течению доминантного ДБЭ у человека
Zhang X. и соавт. (2017 г.)	Синдром Киндлера	Мышь, дефицит Kind1	Жизнеспособная модель	Помогает в более детальном исследовании механизма фоточувствительности при синдроме Киндлера
Rognoni E. и соавт. (2014 г.)	Синдром Киндлера	Мышь, нокаут Kind1	Жизнеспособная модель	Помогает в более детальном изучении патогенеза синдрома Киндлера

About the authors

Arfenya E. Karamova

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology

Email: karamova@cnikvi.ru
ORCID iD: 0000-0003-3805-8489
SPIN-code: 3604-6491

заведующий отделом дерматологии

Россия, Moscow, Korolenko st., 3, building 6

Ekaterina V. Girko

Email: katrin_45_34@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7723-8701
SPIN-code: 9506-0978
Россия

Kseniya M. Aulova

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology

Author for correspondence.
Email: aulovaksenia@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2924-3036
SPIN-code: 8310-7019

младший научный сотрудник отдела дерматологии

Россия, Moscow, Korolenko st., 3, building 6

Xenia I. Plahova

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology

Email: plahova_xenia@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4169-4128
SPIN-code: 7634-5521

ученый секретарь

Россия, Moscow, Korolenko st., 3, building 6

References

Supplementary files