Control materials used for diagnostics of syphilis: types and methods for ensuring stability

Full Text

Качество проведения клинических лабораторных исследований играет важную роль при диагностике заболеваний человека [1—3] и приобретает особое значение в случаях диагностики социально значимых заболеваний, к которым относится сифилитическая инфекция. при обследовании с целью установлении диагноза «сифилис» определяющую роль играют результаты непрямых (серологических) тестов, принцип проведения которых основан на выявлении антител к антигенам возбудителя заболевания — T. pallidum [4—6]. Важным условием обеспечения достоверности этих исследований является проведение внутрилаборатор-ного контроля качества с использованием контрольных материалов, позволяющих по совокупности признаков оценивать качество проведения лабораторного теста и приемлемость данных, полученных в каждой аналитической серии [7—10]. В Российской федерации в качестве контрольных материалов, предназначенных для осуществления контроля качества серологических исследований при диагностике сифилиса, длительное время выпускали лиофилизованные сыворотки крови с различным уровнем антитрепонемных антител, полученные от здоровых и зараженных сифилисом лабораторных животных (кроликов) [11, 12]. Однако в ряде современных методов лабораторных исследований для диагностики сифилиса применяются технологии, основанные на использовании видоспецифических конъюгатов, вступающих во взаимодействие с антителами человека, что исключает использование кроличьих сывороток в качестве адекватных контрольных материалов. Другие контрольные материалы для серодиагностики сифилиса в Российской федерации до последнего времени не производились. На практике во многих лабораториях дерматовенерологических учреждений при проведении серологических исследований на сифилис используют так называемые «сливные» сыворотки — пул образцов, полученных путем объединения сывороток крови человека, ранее исследованных в различных серологических реакциях. Для обеспечения длительного хранения этих сывороток крови применяют сухую борную кислоту (0,02 г на 1 мл), метилмертиолят (в разведении 1:10 000) или замораживание (при -18—20 оС) [11—14]. Однако такие контрольные сыворотки не являются общепризнанными контрольными материалами и не могут быть рекомендованы к применению в клиникодиагностических лабораториях в качестве стандартных контрольных материалов. В ряде работ [15—16] встречаются сведения о производстве на отечественных предприятиях ЗАО «Вектор-Бест» и ЗАО «Медико-биологический союз» лиофилизованных сывороток крови, предназначенных для оценки качества работы лабораторий и тест-систем для диагностики сифилиса, однако указанные материалы до последнего времени не были разрешены к применению в учреждениях здравоохранения Российской федерации. В настоящей статье представлен обзор современных контрольных материалов, применяемых при серодиагностике сифилиса и других социально значимых инфекций, а также подходов к обеспечению их стабильности. Разработка и производство стандартов, калибраторов и контрольных материалов для клинических лабораторных исследований является важным разделом деятельности крупных производственных предприятий и научно-исследовательских центров. Требования и рекомендации по производству, аттестации и внедрению международных биологических стандартов содержатся в нормативных документах, регулярно вы пускаемых Комитетом по стандартизации Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) [17, 18]. В Российской федерации такие нормативные требования были разработаны по отношению к национальным стандартным образцам медицинских иммунобиологических препаратов, которые используются в качестве стандартизованных средств измерения на этапах промышленного производства диагностических наборов реагентов [19]. В зависимости от назначения контрольные материалы биологического происхождения могут выпускаться в виде стандартов, представленных ограниченным количеством невозобновляемых доз-аликвот, или в виде панелей контрольных сывороток, регулярно выпускаемых промышленным способом [17, 18]. Иммунобиологический стандарт, приготовленный на основе сыворотки крови человека, представляет собой образец контрольной сыворотки, обладающий количественно охарактеризованной и выраженной в международных единицах активностью, выявляемой определенным методом [18]. примером такого стандарта является «первый международный стандарт сыворотки крови человека, содержащей антитрепо-немные антитела», разработанный ВОЗ в 1958 г., владельцем и распространителем которого является Национальный институт биологических стандартов и контроля Великобритании (National Institute for Biological standards and control, NIBsc) [19]. примером международного стандарта является также стандарт фурнье для РпГА, латексных тестов и VDRL (Venereal Deceases Research Laboratory), производимый фирмой «La Technique Biologique» при Институте пастера (франция), применяемый для оценки чувствительности тест-систем для диагностики сифилиса полуколичествен-ными методами [20]. Для оценки клинической эффективности новых методов исследования, качества производственных серий диагностических наборов реагентов, проведения внутрилабораторного контроля качества отдельные контрольные материалы могут быть объединены в панели контрольных материалов. Выделяют следующие основные типы панелей контрольных материалов [21—22]: ■ экспертные панели — включают естественные не-разведенные образцы сыворотки крови, содержащие определенный маркер, полностью охарактеризованные методами, официально разрешенными к применению с использованием сертифицированных тест-систем; предназначены для определения аналитической чувствительности метода при регулярной внутрилабораторной и внешней оценке качества исследований; ■ квалификационные панели — состоят из сывороток с разным сочетанием антител к возбудителю заболевания, которые редко встречаются при рутинном тестировании; их используют для тренинга, 8 к № 2, 2012 проверки качества работы персонала, выявления систематических ошибок и неисправностей приборов; ■ верификационные панели — состоят из нативных неразведенных сывороточных образцов с разным уровнем антител к возбудителю заболевания; предназначены для оценки точности выполнения исследований, определения доверительного интервала при валидации и оценке и качества коммерческих наборов реагентов; панели чувствительности — содержат несколько последовательно разведенных образцов, калиброванных относительно международных стандартов; предназначены для оценки аналитической чувствительности тестов; ■ сероконверсионные панели — редкие серии образцов сыворотки, последовательно полученных от одного больного в процессе развития у него заболевания; такие панели характеризуют динамику содержания изучаемого маркера. В соответствии с международными рекомендациями при разработке контрольных материалов в настоящее время отдают предпочтение неразведенным сывороткам крови человека в жидком (нативном) виде, так как они по своим биологическим свойствам наиболее приближены к образцам, с которыми проводят диагностические исследования в клинических лабораториях [23—25]. Таким образом, в качестве исходного сырья при производстве контрольных материалов для диагностики сифилитической инфекции, как правило, используют неразведенные образцы сыворотки крови [9, 24, 26, 27], а также дефибринированную плазму крови [28], полученную от больных с клинически установленным диагнозом сифилиса, показавшие положительные результаты при их исследовании на сифилис. при этом степень активности содержащихся в контрольных материалах антител должна находиться в области значений, определяющих принятие диагностического решения [9, 29]. Необходимым условием создания биологических стандартов и контрольных материалов является обеспечение их стабильности — способности сохранять свои специфические характеристики (уровень активности антител) при их хранении в течение длительного времени (не менее 1—2 лет) [17—18, 23, 30]. На стабильность контрольных материалов оказывает влияние качество сырьевых материалов для их производства. при получении контрольных материалов необходимо соблюдение ряда требований, направленных на сохранение исходной специфической активности, гомогенности и других физико-химических и биологических свойств сырьевого продукта [17, 23, 30]. Сырьевые материалы в процессе их производственной обработки должны сохраняться в контролируемых условиях, предотвращающих возможное негативное влияние на их активность ферментов, кислорода воздуха, света и изменений температурного режима хранения [23]. Неблагоприятное воздействие на конформационную структуру белковых молекул сыворотки крови могут оказывать даже рутинные технологические процедуры, такие как прокачивание плунжерным насосом [31] или резкое встряхивание [12]. Известно несколько методологических приемов, позволяющих обеспечить длительное сохранение специфической активности антител в нативных образцах сывороточного материала (стабильность); они предполагают использование дополнительных факторов физического или химического воздействия (лио-фильное высушивание, внесение консервирующих и стабилизирующих добавок, стерилизующая фильтрация, замораживание и др.) [12, 17, 26, 28, 32—36]. Среди факторов физической природы в первую очередь необходимо отметить стабилизирующее влияние низкой температуры. Сыворотки крови могут длительное время сохранять свою активность при температуре 2—10 °С в случае их стерильности (или при добавлении антимикробных препаратов). Многими исследователями отмечено резкое замедление динамики деградации белковых структур при быстром замораживании растворов белков и их последующем хранении в условиях низкой температуры [17, 31, 37]. Данный подход применялся на практике. Известный мировой производитель контрольных материалов американская фирма «Boston Biomedica Inc» при создании контрольных материалов для реагиновых тестов на сифилис использовала замораживание и хранение сывороток крови при -20 °c. Замораживание сывороток являлось единственным и достаточным условием обеспечения стабильности при создании референсной панели сывороток, содержащих антитела к ВИЧ-1, которую ранее выпускал фГУН «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» Роспотребнадзора (Россия). В данной панели образцы сыворотки крови без дополнительной обработки разливали в пробирки по 10 и 20 мкл и хранили при -20 °c. Эта панель имела статус отраслевого стандартного образца, срок ее годности составлял один год [38]. Более глубокое замораживание контрольных материалов, например при -70 °c, обеспечивает значительно более надежный и воспроизводимый результат сохранения специфической активности антител в контрольных сыворотках [17, 31], что широко применялось при хранении сывороточных образцов в крупных исследовательских центрах, таких как cDc (г. Атланта, США). Однако указанный подход малоприемлем для практического использования в клинических лабораториях учреждений здравоохранения. Условия доставки готовой продукции от производителя к потребителю не позволяют поддерживать во всех звеньях «холодовой транспортной цепи» температурный режим Вестник дерматологии и венерологии Обзор литературы! А 9 (-70—80 оС), необходимый для сохранения исходной активности контрольных материалов. Разработка технологии лиофильного высушивания явилась одним из научных достижений ХХ века, которое широко использовалось для длительного (2—5 лет и более) хранения таких медицинских иммунобиологических препаратов, как вакцины, сыворотки (лечебные и диагностические), антибиотики, штаммы микроорганизмов и др. Однако контрольные материалы в лиофилизованной форме, несмотря на удобство транспортировки и хранения, имели некоторые ограничения при их последующем использовании. при лиофилизации сыворотка крови подвергалась сложной технологической обработке и обезвоживанию, в процессе которых происходили частично необратимые изменения пространственной конформационной структуры белка, сопряженные с формированием стабильных олиго- и мономерных изоформ или ковалентных агрегатов, существенно отличавшихся от исходной нативной формы [39—41]. Даже при однократном замораживании часть анти-трепонемных антител денатурирует, и становятся очевидными ограничения по использованию лиофи-лизованных контрольных материалов для контроля методов серодиагностики сифилиса [42]. Кроме того, при работе с лиофилизованными контрольными материалами высока вероятность ошибок, связанных с потерей массы препарата в процессе высушивания и/или при неаккуратном открывании флаконов, а также при восстановлении их в жидкой форме (погрешности дозирования растворителя, несоблюдение времени, необходимого для конформационных изменений и стабилизации белков в растворе, качество перемешивания) [25, 43]. Каждый из названных факторов может приводить к тому, что пробы контрольных материалов, полученные из одного и того же флакона или флаконов одной серии, существенно отличаются по содержанию в них иммунных антител от указанных производителем контрольных материалов [25, 43]. Кроме этого, контрольные материалы, полученные из лиофилизованных сывороток, обладают повышенной мутностью или опалесценцией [40, 44], что является дополнительным ограничением их применения в ряде серологических тестов [29, 32, 44]. В соответствии с международными рекомендациями [17—18], оптимальной комплектацией иммунобиологических контрольных материалов для проведения лабораторных исследований являются панели контрольных сывороток, включающие образцы, содержащие и не содержащие антитела к изучаемому патогену. при этом производство контрольных материалов из сыворотки крови человека в жидкой нативной форме исключает появление погрешностей измерения, обусловленных подготовительными процедурами при восстановлении лиофилизованных контрольных сывороток. Возможным методологическим подходом к решению проблемы сохранения специфической активности иммунных антител в контрольных материалах, полученных на основе матрицы сыворотки крови человека, является использование высокомолекулярных природных или синтетических соединений и поверхностно-активных веществ, которые за счет электростатической гидрофобной природы связываются с молекулами иммуноглобулинов посредством нековалентных связей, образуя стабильные комплексы. Используемые в качестве консервантов химические реагенты не должны влиять на специфическую активность сывороток и препятствовать проведению исследования. Так, компания Profile Diagnostics (США) при разработке жидких контрольных сывороточных панелей для серодиагностики сифилиса использовала 0,1% раствор азида натрия (неорганическое вещество с формулой NaN3, характеризующееся высокой растворимостью в воде и использующееся в медицине как консервант) [45]. Однако этот реагент в указанной концентрации нестоек в растворе и обладает ингибирующей активностью в отношении фермента пероксидазы хрена, который входит в состав практически всех наборов реагентов для имму-ноферментного анализа [46], что ограничивало практическое применение контрольных материалов данного производителя. Крупный производитель сывороточных панелей и стандартов фирма «Boston Biomedica Inc.» (США) включала в состав контрольных материалов своих панелей консервант Proclin-300 (смесь двух активных изотиазолонов: 2-метил-4-изотиазолин-3-он и 5-хлоро-2-метил-4-изотиазолин-3-он), который при попадании в клетку микроорганизма ингибируют специфические энзимы окислительно-восстановительного цикла Кребса [47], но не влияет на результаты серологического исследования. Некоторые другие производители препаратов, имеющих в своем составе белковые компоненты, использовали в качестве консервирующего средства Bronidox (5-бром-5-нитро-1,3-диоксан, растворенный в 1,2 пропиленгликоле), обладающий высокой антибактериальной активностью в конечной концентрации 0,1—0,5% [48]. Этот реагент широко применяли при производстве препаратов, используемых в иммунологии и косметологии. В качестве консервантов также использовались и другие реагенты, например борная кислота и ее соли, различные антибактериальные препараты, мер-тиолят [11, 26, 49, 50], этиленгликоль [51], этилендиа-минтетраацетат (ЭДТА) [52]. Мертиолят (орто-этил-ртуть-тиосалицилат натрия, органическое соединение ртути ароматического ряда) длительное время широко использовали в качестве консерванта при производстве вакцин и сывороток. Для сохранения активности панелей 10 L № 2, 2012 контрольных материалов, используемых на различных этапах производственного цикла, мертиолят применяется такими отечественными производителями, как ЗАО «Вектор-Бест» и ЗАО «Медико-биологический союз» [44]. показано, что внесение в состав длительно сохраняемых образцов сыворотки крови антикоагулянтов, таких как ЭДТА, способствует связыванию ионов тяжелых металлов, являющихся инициаторами перекис-ных процессов, и сохранению активности белковых структур [52]. при замораживании растворов белков и их последующей лиофилизации в качестве стабилизирующих веществ часто добавляют различные углеводы, сахара или полимеры [49, 53—55]. Исследования K. Imamura и соавт. (2003) показали, что при добавлении дистиллированной воды к лиофизованному бычьему сывороточному альбумину только в присутствии сахаров (сахарозы, трегалозы или декстранов) наблюдалось полное восстановление нативной пространственной структуры молекул белка — рефол-динг, а в образцах без добавления сахаров этого восстановления не происходило [34]. Самым распространенным стабилизатором углеводного происхождения является сахароза, однако имеются данные, что наилучшими стабилизирующими свойствами обладает другой дисахарид — трегалоза, состоящий из двух остатков D-глюкозы, соединенных а, а-гликозидной связью [55—57]. В других исследованиях также было отмечено положительное влияние сахаров на сохранность белковых структур, присутствующих в растворах препаратов [58], но предпочтение отдавалось ди- и олигосахаридам, так как более крупные углеводы способны образовывать альдегиды [49]. Белки плазмы и сыворотки крови в процессе их длительного хранения в незамороженном виде могут подвергаться деградации за счет присутствия ферментов, обладающих протеолитической активностью [59—61]. Для обеспечения длительного хранения контрольных материалов, обладающих специфической иммунной активностью, необходима разработка стабилизирующих добавок, способных ингибировать протеоли-тическое воздействие ферментов сыворотки крови. К числу таких стабилизирующих добавок могут быть отнесены ингибиторы протеолитических ферментов — антитрипсины, в частности а1-антитрипсин — гликопротеид, который синтезируется в печени и подавляет активность многих протеолитических знзимов: трипсина, химотрипсина, плазмина, тромбина, эластазы, гиа-луронидазы, протеаз лейкоцитов [62]. Для предотвращения бактериального обсеменения контрольных материалов широко применяются ингредиенты, обладающие выраженной антибактериальной и антигрибковой активностью. В этих же целях применяется консервирование путем стерилизующей фильтрации и последующего хранения при температуре от 2 до 8 °c [26]. В Американском центре по контролю распространения заболеваний при приготовлении из плазмы крови референсных материалов и контрольных образцов для квалификационного тестирования серологических лабораторий финальная обработка сырьевого материала проводится путем двустадийного фильтрования: сначала через фильтр с порами 0,45 мкм, а затем — 0,22 мкм [24]. Российские производители контрольных материалов с целью удаления бактерий и балластных белков используют фильтры с диаметром пор 0,8 и 0,45 мкм [44]. Таким образом, как следует из приведенного обзора источников литературы, создание современных контрольных материалов, предназначенных для контроля качества серологических исследований для диагностики сифилитической инфекции, должно предусматривать разработку и опытно-экспериментальное обоснование оптимального состава стабилизирующих реагентов и условий хранения контрольных материалов, позволяющих обеспечить сохранность специфической активности антител к возбудителю сифилиса. I

About the authors

S V Rotanov

Email: rotanov@cnikvi.ru

N V Frigo

T Ye Manukiyan

References

Supplementary files