Реконструированный эпидермис человека in vitro — модель для фундаментальных и прикладных исследований кожи человека

Полный текст

Введение

Биология кожи и ее придатков интенсивно изучается на протяжении многих лет. Исследования в этой области дали обширные и значимые результаты, раскрывающие механизмы многих процессов, имеющих общебиологическое значение. Среди них — регуляция клеточной пролиферации, дифференциации, трансформации, стволовые клетки и их ниши, эпителио-мезенхимные взаимодействия, морфогенез, регенерация, заболевания кожи и многие др. [1—10]. Кожа представляет собой сложный орган, состоящий из эпидермиса, дермы, подкожной жировой клетчатки и придатков кожи, включая волосяной фолликул, сальную и потовую железы.

Эпидермис — наружный слой кожи, который является первым защитным барьером организма. Хорошо известно, что различные типы эпителиев в организме утрачивают мертвые клетки путем слущивания и самообновляются за счет активности стволовых клеток. Эпидермальные стволовые клетки располагаются в базальном слое эпидермиса на базальной мембране и вместе с потомками образуют эпидермальные пролиферативные единицы [11]. На основании имеющихся представлений об организации тканей их можно отнести к структурно-функциональным единицам [4, 12, 13].

Гомеостаз эпидермиса, как известно, поддерживается за счет баланса между пролиферацией базальных клеток и дифференцировкой/стратификацией супрабазальных. В начале дифференцировки базальные кератиноциты прекращают пролиферировать и, оказавшись в супрабазальном клеточном слое, запускают программу дифференцировки, кульминацией которой является корнификация и потеря клеточного ядра. Определение точной последовательности событий коммитирования и дифференцировки как на уровне отдельных клеток, так и в составе тканей до сих пор является важной темой фундаментальных исследований. Базальный слой кератиноцитов контактирует с базальной мембраной и характеризуется высоким пролиферативным потенциалом. Вышележащие слои образованы кератиноцитами на разных стадиях дифференцировки: шиповатый слой, гранулярный и роговой (схема 1). Процесс терминальной дифференцировки начинается с выхода базальных кератиноцитов из клеточного цикла и утраты адгезии к базальной мембране. Формирование шиповатого слоя кератиноцитов сопряжено с подавлением экспрессии генов, экспрессирующихся в базальных кератиноцитах; увеличением экспрессии специфических генов, необходимых для клеточной дифференциации; поддержанием статуса шиповатых кератиноцитов и регуляцией их последовательного перехода в гранулярные кератиноциты. Когда клетки покидают базальный слой и переходят в супрабазальное положение, они начинают экспрессировать такие «ранние маркеры» дифференцировки, как цитокератины 1,10 и инволюкрин. По мере перехода в гранулярный слой кератиноциты синтезируют «поздние маркеры»: белки роговой оболочки лорикрин и стабильный инволюкрин, сшитый трансглутаминазой; филаггрин, связывающий кератиновые филаменты в макрофибриллы и накапливающийся в виде кератогиалиновых гранул. Белки роговой оболочки синтезируются и накапливаются под плазматической мембраной гранулярных клеток. На поздних этапах терминальной дифференцировки происходит разрушение органелл и ядер. Мертвые клетки рогового слоя совместно с липидной оболочкой создают непроницаемый барьер и впоследствии сменяются нижележащими клетками, слущиваясь с поверхности эпидермиса [14].

 

Схема 1. Строение эпидермиса [14]

 

Цель исследования: разработать методику получения тканеинженерного реконструированного эпидермиса (РЭ) человека in vitro, охарактеризовать стратифицированные слои кератиноцитов по наличию экспрессии белков-маркеров соответственно структуре нативного эпидермиса человека.

Материалы и методы

Порядок работы с биоматериалом человека утвержден Комиссией по этике ИБР РАН.

Выделение первичных кератиноцитов человека

Первичные клеточные культуры были выделены из биоптатов кожи, полученных после круговой пластики лица с информированного согласия пациентов. Образцы транспортировали в среде DMEM (ПанЭко) с добавление 4 ммоль глутамина (Sigma) и 0,05 мг/мл гентамицина (ПанЭко). Далее все операции производили в стерильных условиях с применением стандартных методов асептики. Для предотвращения контаминации клеточных культур биоптат кожи промывали раствором Хэнкса (ПанЭко) с добавлением 0,15 мг/мл гентамицина. Затем биоптат кожи помещали в 0,1% раствор диспазы (Gibco) в среде ДМЕМ и инкубировали при 4 °С в течение 12—14 ч. Далее с помощью пинцета эпидермис отделяли от дермы. Для выделения базальных кератиноцитов эпидермис погружали в раствор 0,25% трипсина с ЭДТА (Gibco) и инкубировали при 37 °С в течение 15 мин с последующим интенсивным встряхиванием и осаждением на центрифуге при 400 g в течение 5 мин. Осадок ресуспендировали в культуральной среде для первичных кератиноцитов (CnT-07 (Cell’n’Tech)) и высевали на культуральный пластик (Corning), предварительно покрытый коллагеном I типа.

Выделение первичных фибробластов человека

Для выделения фибробластов дерму погружали в 0,2% раствор коллагеназы (Worthington) в среде ДМЕМ, измельчали с помощью глазных ножниц до фрагментов размером менее 1 мм³ и инкубировали при 37 °С в течение 3—4 ч. Полученную взвесь осаждали центрифугированием при 400 g в течение 5 мин. Осадок ресуспендировали в культуральной среде для первичных фибробластов (DMEM с добавлением 10% ЭТС (Capricorn), GlutaMAX-I (Gibco), пирувата натрия (Gibco), пенициллина и стрептомицина (Gibco) в соотношении 1:1 со средой AmnioMAX-II (Gibco)) и высевали на культуральный пластик. Первичные фибробласты человека использовали в качестве фидерного слоя для базальных кератиноцитов.

Культивирование кератиноцитов и фибробластов в 2D условиях

Кератиноциты культивировали на пластике, покрытом коллагеном. Первичные фибробласты культивировали на пластике без покрытия. Культуры клеток содержали в инкубаторе с 5% СО₂ и насыщающей влажностью при 37 °С. Культуры пассировали по достижении клетками 70% конфлюэнтности в соотношении 1:3. Смену среды осуществляли через каждые 2 дня.

Создание и культивирование 3D реконструированного эпидермиса человека in vitro

Для культивирования клеток на границе среда-воздух использовали мембранные вставки для мультилуночных планшетов с диаметром пор 0,4 мкм (SPL). Фибробласты высевали на мембрану в среде для первичных фибробластов и культивировали 7 дней в погруженном состоянии. Смену среды осуществляли через каждые 2—3 дня. Кератиноциты высевали поверх фибробластов и культивировали 3 дня в погруженном состоянии в среде CnT-07. Далее заменяли среду на среду для стратификации кератиноцитов (CnT-Airlift (Cell’n’Tech)) и культивировали 3 дня в погруженном состоянии. Далее создавали условия культивирования на границе среда-воздух (схема 2). Культивирование продолжали в течение 2 недель. Смену среды осуществляли через каждые 2—3 дня. Сформировавшиеся эквиваленты фиксировали и замораживали для дальнейших исследований.

 

Схема 2. Процесс создания 3D РЭ

 

Получение криосрезов

Для гистологического исследования РЭ фиксировали в 10% забуференном формалине (BioVitrum) в течение суток, после чего промывали PBS (БиолоТ) 3 раза в течение 1 ч и проводили через 15% и 30% растворы сахарозы (Sigma-Aldrich) на PBS в течение 2 суток. Далее РЭ заключали в среду для формирования криоблоков (Tissue-Tek, SAKURA) и охлаждали в гексане при –40 °С. Криоблоки РЭ хранили при –70 °С. Нативную кожу человека после промывки в физрастворе погружали в среду для формирования криоблоков и охлаждали в парах азота, криоблоки хранили при –70 °С. Для гистологического и иммуногистохимического (ИГХ) анализа использовали срезы толщиной 5 мкм, полученные на криостате (Microm HM 525, Thermo Scientific). Полученные срезы высушивали при комнатной температуре в течение суток, срезы нативной кожи человека перед окраской фиксировали в 10% забуференном формалине в течение 10 мин, промывали 3 раза по 5 мин DPBS (ПанЭко).

Гистологическое исследование

Для морфологического анализа срезы окрашивали гематоксилин-эозином (BioVitrum) по стандартному протоколу и заключали в витрогель (BioVitrum).

Иммуногистохимическое исследование

Срезы инкубировали с первичными антителами, разведенными в блокирующем растворе (PBS, 10% ЭТС, 0,3% TRITON X-100 (Sigma)) во влажной камере при +4 °С в течение 12—14 ч. Далее применяли вторые антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена ImmPRESS REAGENT KIT (MP-7402 и MP-7401) по стандартному протоколу, ядра клеток докрашивали гематоксилином. Окрашенные срезы заключали в витрогель.

Список использованных в работе первичных антител

Anti-Keratin 10 (Santa Cruz Biotechnology, sc23877); anti-Keratin 14 (Abcam, ab181595); anti-Loricrin (Abcam, ab24722); anti-Ki67 (Abcam, ab16667); anti-Laminin 5 (Abcam, ab14509); anti-Plectin abcam (Abcam, ab32528).

Микроскопия

Съемку гистологических препаратов осуществляли на микроскопе Keyence BZ-9000 с постобработкой фотографий с использованием программного обеспечения Fiji [15].

Результаты

Гистологическое исследование показало формирование многослойной структуры эпидермиса в модели РЭ. Кератиноциты в эквиваленте подвергаются стратификации и дифференциации. На препарате хорошо различим слой базальных кератиноцитов, которые имеют кубическую форму, расположены в основании эпидермиса на базальной мембране. Над базальным слоем расположен слой шиповатых кератиноцитов, далее гранулярный слой и роговой слой (рис. 1). В нашей модели РЭ наблюдается около 8—10 слоев жизнеспособных клеток. В роговом слое насчитывается около 10 слоев терминально дифференцированных кератиноцитов, в «конченом» итоге слущивающихся с его поверхности (рис. 1А).

 

Рис. 1. Структура эпидермиса: А — РЭ, Б — кожа человека (1 — базальный слой; 2 — шиповатый слой; 3 — гранулярный слой; 4 — роговой слой). Окраска гематоксилином и эозином, ×400

 

ИГХ-исследование экспрессии маркера пролиферирующих клеток Ki67 позволило выявить пролиферирующие кератиноциты, которые преимущественно детектируются в базальном слое, что соответствует литературным данным относительно эпидермиса (рис. 2) [16]. Пролиферирующие клетки базального слоя проходят серию морфологических и биохимических изменений, которые завершаются формированием мертвых, уплощенных, энуклеированных чешуек рогового слоя. Чешуйки рогового слоя — это терминально дифференцированные кератиноциты, скрепленные вместе липидами. Роговой слой РЭ подобно роговому слою нативной кожи является функциональным барьером.

 

Рис. 2. Пролиферация базальных клеток в РЭ: А — РЭ, Б — кожа человека. Стрелка указывает на пролиферирующие ядра. ИГХ-исследование, ×400

 

Базальная мембрана важна в поддержании пролиферации базальных кератиноцитов и сохранении эпидермальных стволовых клеток. Она определяет полярность базальных кератиноцитов. Поляризация выражается в неоднородном распределении мембранных белков базальных кератиноцитов и асимметрии макродоменов плазматической мембраны. В клетке базального кератиноцита выделяют два мембранных домена: апикальный и базолатеральный. Последний граничит с базальной мембраной. Это свойство базальных кератиноцитов называют апико-базальной асимметрией.

Интегриновые рецепторы связывают клетки с базальной мембраной и способствуют сохранению пролиферативного статуса базальных кератиноцитов [17, 18]. Считается, что снижение экспрессии интегринов приводит к откреплению клеток от базальной мембраны и их дифференцировке.

ИГХ-исследование экспрессии плектина в РЭ показало наличие этого белка в зоне прикрепления базальных кератиноцитов к базальной мембране (рис. 3В, В'). Плектин является линкерным белком между кератиновыми филаментами кератиноцитов и интегрином α6β4 в структуре гемидесмосом. Молекулы интегрина α6β4 прочно закрепляют клетки на базальной мембране, связываясь с ее компонентами, преимущественно с ламинином 5 (α3β3γ2) [19]. Базальные кератиноциты РЭ активно синтезируют ламинин 5, на что указывает наличие его экспрессии в эквивалентах (рис. 3А, А'). Таким образом, базальные кератиноциты в РЭ сохраняют пролиферативную активность, успешно синтезируют белки базальной мембраны и формируют гемидесмосомы, контакты, которые обеспечивают их надежное сцепление с белками внеклеточного матрикса. ИГХ-исследование экспрессии ламинина 5 подтвердило наличие правильно сформированной базальной мембраны в РЭ.

 

Рис. 3. Идентификация зоны базальной мембраны и гемидесмосом в РЭ: Экспрессия ламинина 5 (А, А', Б). Экспрессия плектина (В, В', Г). А, А', В, В' — РЭ; Б, Г — кожа человека. ИГХ-исследование, ×400. Положительные по маркерам зоны окрашены коричневым

 

Прогрессия дифференцировки кератиноцитов хорошо наблюдается при ИГХ-исследовании экспрессии белков — маркеров дифференцировки кератиноцитов: цитокератинов 14 и 10, лорикрина (рис. 4). Базальные и мало дифференцированные супрабазальные кератиноциты экспрессируют кератин 14 (рис. 4A). Кератиноциты, находящиеся на ранних стадиях дифференцировки и располагающиеся в верхних супрабазальных слоях, экспрессируют маркер ранней дифференцировки кератин 10 (рис. 4Б). Кератиноциты гранулярного слоя характеризуются экспрессией маркера поздней дифференцировки лорикрина. Экспрессирующие лорикрин кератиноциты граничат с терминально дифференцированными кератиноцитами рогового слоя (рис. 4В). Экспрессия маркеров дифференцировки, соответствующая нативному эпидермису, доказывает функциональность РЭ.

 

Рис. 4. Дифференциация и стратификация эпидермиса в РЭ: Экспрессия цитокератина 14 (А, Г); цитокератина 10 (Б, Д); лорикриина (В, Е). А, Б, В — РЭ; Г, Д, Е — кожа человека. ИГХ-исследование, ×400. Положительные по маркерам зоны окрашены коричневым

 

Обсуждение

Эквиваленты кожи являются довольно простым тканевым конструктом, но тем не менее разрабатывались они на протяжении многих лет. Также биоинженерная кожа всегда вызывала большой интерес как в качестве модельной системы биологии и патологии кожи, так и для тестирования терапевтических средств и косметологических продуктов. Учитывая существующий дефицит и ряд ограничений применения донорской кожи, эквиваленты кожи крайне востребованы для увеличения эффективности заживления ран при различных поражениях кожи (механические повреждения, термические, химические ожоги, не поддающиеся лечению длительно незаживающие раны) [20, 21]. Многие заменители кожи являются коммерческими продуктами и могут содержать различный вариант биоразлагаемого матрикса, как самостоятельный элемент или в сочетании с клеточным компонентом [22, 23]. Основной целью применения эквивалентов кожи, как правило, является разрешение ранозаживления, его ускорение и предотвращение формирования рубцов. Ранее мы показали, что, например, коллагеновый гель, заселенный клетками кожи, в качестве трансплантата на мышиной модели способствует уменьшению воспаления и эффективному заживлению ран: активной васкуляризации грануляционной ткани, ремоделированию дермы в месте раны и быстрой эпителизации [24]. Кроме того, ряд моделей кожи разработан для развития исследований и тестирования фармакологических, косметологических препаратов, изобретены различные аналоги органов, в том числе так называемые органы-на-чипах [25].

Создание эквивалента кожи основано на самопроизвольной организации клеток кожи: фибробластов и кератиноцитов in vitro, формирующих структуру, подобную коже. В модели РЭ, подобно нативному эпидермису, формируются все слои кератиноцитов, находящихся на разных стадиях дифференцировки. Базальные кератиноциты РЭ пролиферируют, синтезируют белки базальной мембраны и формируют гемидесмосомы — прочные контакты, крепко удерживающие их на базальной мембране и опосредующие поляризованное состояние базальных кератиноцитов. Модель РЭ позволяет анализировать особенности экспрессии и секреции отдельных белков, в совокупности с особенностями процессов пролиферации, стратификации и дифференцировки на уровне эпидермального гомеостаза.

Получение тканеинженерных эпидермальных эквивалентов кожи важно для выявления механизмов патогенеза генодерматозов. Изменения в структуре и паттерне экспрессии структурных белков кожи влекут за собой особенности и нарушения межклеточных взаимодействий, для их визуализации и анализа удобно использовать модели эквивалентов кожи. Эпидермальные эквиваленты из культивируемых клеток больных применяются для оценки воздействия генотерапии как на кератиноциты, так и на фибробласты. Модели эпидермальных эквивалентов использовались для оценки генетической коррекции гена SPIND5 при синдроме Нидертона, приводящего к нарушениям кератинизации [26]; для коррекции гена COL7A1 при дистрофическом буллезном эпидермолизе [27], коррекции KRT10 при эпидермолитическом ихтиозе [28]. Эпидермальные эквиваленты используются для тестирования новых лекарственных препаратов. Например, на эквивалентах кожи из культивируемых клеток больных разными формами генодерматозов был показан терапевтический эффект от применения аминогликозидов, амелиоративный эффект от интрадермальных инъекций рекомбинантных белков, как в случае с COL7A1 [29]. Показан позитивный эффект от воздействия гентамицина, генецитина и других лекарственных препаратов, обеспечивающих трансляцию мРНК с предварительными стоп-кодонами, это частый тип патологических мутаций, приводящий либо к деградации транскрипта, либо к появлению укороченных нефункциональных форм белка. «Проскакивание» предварительных стоп-кодонов в ряде случаев, в зависимости от расположения мутации, приводит к появлению белка и частичному восстановлению нормального физиологического состояния клетки [30—33].

Трехмерная природа эквивалентов кожи позволяет моделировать различные патологические состояния кожи, такие как, например, атопический дерматит [33], псориаз [35] и генодерматозы [36], за счет включения в эквиваленты клеток пациентов, гиперпигментацию [37] за счет включения в эквиваленты меланоцитов [38], клеток Лангерганса [39].

В онкологии модели кожи используются для изучения ранних стадий развития меланом [40]. Очень активно эквиваленты кожи используются в исследованиях трансдермальной доставки лекарств и других фармакологических субстанций. Также эквиваленты кожи могут быть использованы для изучения влияния различных факторов и фармакологических агентов на биогенез и реэпителизацию кожи in vitro [41], регуляцию дифференцировки кератиноцитов, абсорбцию и иммунотоксичность, реакцию кожи на коррозирующие вещества, раздражители и аллергены [42], а также способность кератиноцитов контрактировать (сокращать) матрикс или рану [43], для оценки фототоксичности [44]. Более того, среда при культивировании на границе раздела фаз может быть собрана для анализа выбрасываемых в нее клетками медиаторов и/или метаболитов, что обеспечивает количественный и объективный результат в сравнении с такими субъективными параметрами, как эритемы и отеки in vivo.

В последнее время все большую значимость приобретают исследования роли микробиома в регуляции гомеостаза различных органов и их систем [45]. Кожа также имеет свой микробиом, который участвует в поддержании иммунитета и барьерной функции этого органа. РЭ in vitro может являться инструментом для изучения эпителиального и кожного микробиома. Учитывая, что в фармацевтической и косметологической промышленности растет число применяемых синтетических соединений и составов и ранее испытания на животных были единственным способом оценить потенциал веществ и смесей в их способности наносить вред коже, в настоящее время модели РЭ позволяют производить оценку токсичности in vitro. РЭ плотно контактирует со стенками лунки, формируя эпидермальный барьер, за счет этого предотвращается утечка жидких тестируемых веществ вдоль внутренней стенки. РЭ позволяет определять коррозийный и раздражающий потенциал определенных ингредиентов, что необходимо для их классификации и маркировки [21, 46, 47]. Скрининг веществ-раздражителей кожи проводится по стандартам, утвержденным организацией экономического сотрудничества и развития (ОЭСР) [21, 47]. Таким образом, модель РЭ находит применение в качестве тест-системы в области клеточной биологии, регенеративной медицины, старения и заболеваний кожи, разработки лекарств и косметических средств и др. областях (схема 3).

 

Схема 3. Сферы применения модели РЭ

 

Заключение

Разработана модельная система РЭ человека in vitro. В составе РЭ формируется 8—10 слоев жизнеспособных клеток и около 10 слоев уплощенных корнеоцитов рогового слоя. Экспрессия маркеров пролиферации и дифференцировки кератиноцитов РЭ соответствует структуре нативного эпидермиса, таким образом процесс стратификации и дифференцировки в РЭ протекает аналогично таковому в эпидермисе in vivo. Полученные данные обосновывают применение модели РЭ в фундаментальных и прикладных исследованиях в области биологии кожи в норме и при патологии.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 19-29-04044.

Работа Е.А. Воротеляк и А.Л. Риппа выполнена в рамках раздела Госзадания ИБР РАН 2020 г. № 0108-2019-0004.

Полученные клеточные линии были депонированы в Уникальной научной установке Коллекции клеточных культур Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.

Об авторах

Аркадий Константинович Бейлин

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН; РНИМУ им. Пирогова

Email: arkadii.beilin@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9868-5623

аспирант лаборатории клеточной биологии; младший научный сотрудник отдела регенеративной медицины НИИ трансляционной медицины

Россия, Москва

Александра Леонидовна Риппа

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Email: rippa86@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-7300-8466
ResearcherId: I-2103-2014

к.б.н., научный сотрудник лаборатории клеточной биологии

Россия, Москва

Валентин Ильич Шаробаро

РНИМУ им. Пирогова

Email: sharobarovi@mail.ru

проф. РАН, д.м.н., профессор, профессор кафедры пластической, реконструктивной хирургии, косметологии и клеточных технологий

Россия, Москва

Надежда Георгиевна Гурская

РНИМУ им. Пирогова; Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Email: ngurskaya@mail.ru

к.б.н., старший научный сотрудник отдела регенеративной медицины НИИ трансляционной медицины; научный сотрудник лаборатории клеточной биологии 

Россия, Москва

Екатерина Андреевна Воротеляк

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: vorotelyak@yandex.ru

чл.-корр. РАН, д.б.н., заведующий лабораторией клеточной биологии

Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы