Коамплификация участков генома Mycobacterium leprae методом ПЦР в реальном времени: обнаружение возбудителя и возможность полуколичественной оценки бактериальной нагрузки

Обложка


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Цель исследования. Разработка метода коамплификации однокопийных генов и повторяющихся элементов генома Mycobacterium leprae при анализе клинического материала от больных лепрой с оценкой клинической значимости результатов подобного исследования.
Материалы и методы. Материалом для исследования явились образцы скарификатов и биоптатов кожи от больной Р. с диагнозом «А30.5 Лепра. Мультибациллярная форма. Лепроматозный тип. Активная стадия». Поиск ДНК M. leprae в клиническом материале проводили методом ПЦР в реальном времени (РТ-ПЦР) с использованием праймеров и гидролизуемых зондов к однокопийным видоспецифичным генам rpoB (кодирует β-субъединицу бактериальной РНК-полимеразы), sodA (кодирует фермент супероксиддисмутазу) и mntH (кодирует белок марганцевый транспортер), а также некодирующему многокопийному элементу генома — RLEP.
Результаты. С использованием различных вариантов РТ-ПЦР получен согласующийся результат о присутствии или отсутствии ДНК M. leprae в отдельных исследованных клинических образцах. Подтверждена высокая чувствительность ПЦР-детекции многокопийного элемента генома RLEP в сравнении с однокопийными генами rpoB, sodA и mntH, заключающаяся в уменьшении количества циклов амплификации (Ct), необходимых для превышения порогового уровня флуоресценции гидролизующихся зондов, и приводящая к максимальной интенсивности сигнала флуоресценции. При построении стандартных графиков калибровки накопления флуоресцентного сигнала к одновременно анализируемым участкам генома M. leprae в разведениях от 1 до 1000 продемонстрированы четкие различия результатов коамплификации в зависимости от количественного присутствия детектируемой ДНК.
Выводы. Коамплификация участков генома M.leprae с разной степенью копийности методом РТ-ПЦР обеспечивает эффективную детекцию ДНК возбудителя лепры в клиническом материале и формирует основу для полуколичественной оценки бактериальной нагрузки в кожных биоптатах и скарификатах.

Об авторах

Д. А. Вербенко

Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии
Министерства здравоохранения Российской Федерации

Автор, ответственный за переписку.
Email: verbenko@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-1104-7694
к.б.н., и. о. заведующего отделом лабораторной диагностики ИППП и дерматозов 

107076, Российская Федерация, г. Москва, ул. Короленко, д. 3, стр. 6 Россия

А. Э. Карамова

Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии
Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-3805-8489
к.м.н., заведующий отделом дерматологии 

107076, Российская Федерация, г. Москва, ул. Короленко, д. 3, стр. 6 Россия

В. С. Соломка

Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии
Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-6841-8599
д.б.н., заместитель директора по научной работе 

107076, Российская Федерация, г. Москва, ул. Короленко, д. 3, стр. 6 Россия

А. А. Кубанов

Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии
Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-7625-0503

д.м.н., профессор, член-корреспондент РАН, и. о. директора 

107076, Российская Федерация, г. Москва, ул. Короленко, д. 3, стр. 6

Россия

Д. Г. Дерябин

Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии
Министерства здравоохранения Российской Федерации
107076, Российская Федерация, г. Москва, ул. Короленко, д. 3, стр. 6

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-2495-6694
д.б.н., ведущий научный сотрудник отдела лабораторной диагностики ИППП и дерматозов 

107076, Российская Федерация, г. Москва, ул. Короленко, д. 3, стр. 6 Россия

Список литературы

  1. Fischer M. Leprosy — an overview of clinical features, diagnosis, and treatment. J Dutsch Dermatol Ges. 2017;15(8):801–827.
  2. Ridley D. S., Jopling W. H. Classification of leprosy according to immunity. A five-group system. Int J Lepr Other Mycobact Dis. 1966;34(3):255–273.
  3. МКБ 10 — Международная классификация болезней 10-го пересмотра. Версия: 2019. https://mkb-10.com/index.php?pid=174
  4. World Health Organization. Regional Office for South-East Asia, Global Leprosy Programme. Global leprosy strategy 2016–2020: monitoring and evaluation guide accelerating towards a leprosy-free world. New Delhi: WHO Regional Office for South East Asia; 2017. http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/254907/9789290225492
  5. Образцова О. А. Молекулярно-биологические методы исследования в лабораторной диагностике лепры: эпидемиологический анализ, генетические детерминанты резистентности к антимикробным препаратам. Вестник дерматологии и венерологии. 2017;6:34–40.
  6. Cho S. N., Yanagihara D. L., Hunter S. W., Gelber R.H., Brennan P. J. Serological specificity of phenolic glycolipid 1 from M. leprae and use in serodiagnosis of leprosy. Infect Immun. 1983;41(3):1077–1083.
  7. Duthie M. S., Balagon M. F., Maghanoy A., Orcullo F. M., Cang M., Dias R. F. et al. Rapid quantitative serological test for detection of infection with Mycobacterium leprae, the causative agent of leprosy. J Clin Microbiol. 2014:52(2):613–619.
  8. Fujiwara T., Hunter S. W., Cho S. N., Aspinall G. O., Brennan P. J. Chemical synthesis and serology of the disaccharides and trisaccharides of phenolic glycolipid antigen from leprosy bacillus and preparation of a disaccharide protein conjugate for serodiagnosis of leprosy. Infect Immun. 1984;43(1):245–252.
  9. Santos A. R., De Miranda A. B., Sarno E. N., Suffys P. N., Degrave W. M. Use of PCR-mediated amplification of Mycobacterium leprae DNA in different types of clinical samples for the diagnosis of leprosy. J Med Microbiol. 1993;39(4):298–304.
  10. Martinez A. N., Talhari C., Moraes M. O., Talhari S. PCR-based techniques for leprosy diagnosis. From the laboratory to the clinic. PLoS Negl Trop Dis. 2014;8(4):e2655. doi: 10.1371/journal.pntd.0002655
  11. Pathak V. K., Singh I., Turankar R. P., Lavania M., Ahuja M., Singh V. et al. Utility of multiplex PCR for early diagnosis and household contact surveillance for leprosy. Diagn Microbiol Infect Dis. 2019;95(3):114855. doi: 10.1016/j.diagmicrobio.2019.06.0078
  12. Turankar R. P., Pandey S., Lavania M., Singh I., Nigam A., Darlong J. et al. Comparative evaluation of PCR amplification of RLEP, 16S rRNA, rpoT and SodA gene targets for detection of Mycobacterium leprae DNA from clinical and environmental samples. Int J Mycobacteriol. 2015;4(1):54–59.
  13. Azevedo M. C., Ramuno N. M., Fachin L. R., Tassa M., Rosa P. S., Belone A. F. et al. qPCR detection of Mycobacterium leprae in biopsies and slit skin smear of different leprosy clinical forms. Braz J Infect Dis. 2017;21(1):71–78. doi: 10.1016/j.bjid.2016.09.017
  14. Образцова О. А., Вербенко Д. А., Карамова А. Э., Семенова В. Г., Кубанов А. А., Дерябин Д. Г. Совершенствование ПЦР-диагностики лепры путем амплификации видоспецифичного повторяющегося фрагмента генома Mycobacterium leprae. Клиническая лабораторная диагностика. 2018;63(8):511–516. doi: 10.18821/0869-2084-2018-63-8-511-516
  15. Woods S. A., Cole S. T. A family of dispersed repeats in Mycobactenium leprae. Mol Microbiol. 1990;4:1745–1751.
  16. Martinez A. N., Lahiri R., Pittman T. L., Scollard D., Truman R., Moraes M.O. et al. Molecular determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR. J Clin Microbiol. 2009;47(7):2124–2130.
  17. Chaitanya V. S., Cuello L., Das M., Sudharsan A., Ganesan P., Kanmani K. et al. Analysis of a novel multiplex polymerase chain reaction assay as a sensitive tool for the diagnosis of indeterminate and tuberculoid forms of leprosy. Int J Mycobacteriol. 2017;6(1):1–8.
  18. Banerjee S., Sarkar K., Gupta S., Mahapatra P. S., Gupta S., Guha S. et al. Multiplex PCR technique could be an alternative approach for early detection of leprosy among close contacts: a pilot study from India. BMC Infect Dis. 2010;10:252.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Вербенко Д.А., Карамова А.Э., Соломка В.С., Кубанов А.А., Дерябин Д.Г., 2019

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 60448 от 30.12.2014.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах