Role of polymorphisms of PERP gene in the development of acantholysis in patients with pemphigus vulgaris

Full Text

Ш Истинная акантолитическая пузырчатка - потенциально летальный дерматоз, ведущая роль в патогенезе которого в настоящее время отводится аутоиммунным реакциям, приводящим к акантолизу [1, 2]. Большое число работ посвящено исследованиям механизмов инициации аутоиммунных реакций, а также внутриклеточных процессов, приводящих к акантоли-зу [3, 4]. Несмотря на увеличение продолжительности жизни больных истинной акантолитической пузырчаткой после введения в схему лечения дерматоза глюкокортикостероидных препаратов, пациенты нередко умирают от осложнений иммуносупрессивной терапии. Данное обстоятельство вызывает необходимость исследования механизмов развития заболевания, в том числе на уровне генетического аппарата клетки, с целью выявления новых терапевтических мишеней. В настоящее время считается, что у пациентов, генетически предрасположенных к развитию истинной акантолитической пузырчатки, антигенпредставляю-щие (например дендритные) клетки, распознав компоненты десмосом как чужеродные, презентируют антиген Т-клеткам (Th0), инициируя их дифференцировку на Т-хелперные (Th) клетки 1-го и 2-го типов. В свою очередь, аутореактивные Т-клетки активируют синтез аутоантител В-клетками [1, 2]. Аутоантитела у больных истинной акантолитической пузырчаткой образуются не только к компонентам десмосом, но и к другим собственным антигенам эпидермиса. Именно аутоантителам приписывается основная патогенетическая роль в патогенезе истинной акантолитической пузырчатки. поэтому ряд исследований был направлен на изучение механизмов потери связи кератиноцитов друг с другом под действием аутоантител. Доказано, что, откладываясь в межклеточных пространствах эпидермиса, антитела инициируют передачу сигналов от мембранных рецепторов в цитоплазму и ядро кератиноцитов. это приводит к изменениям цитоскелета, погружению десмосом в цитоплазму с их последующим разрушением в лизосомах, активации каскада ферментов апоптоза, деградации и массивному коллапсу структурных белков, что завершается уменьшением объема клеток и, как следствие, разрывом оставшихся десмосом [2, 5, 6]. Именно активацией апоптотических сигнальных путей можно было бы отчасти объяснить морфологические изменения клеток эпидермиса при истинной акантолитической пузырчатке, а именно деградацию и массивный коллапс структурных белков с последующим уменьшением объема клеток. Однако программа апоптоза реализуется не полностью, и клетки не гибнут, а лишь претерпевают морфологические изменения, приводящие к формированию клеток Тцанка и клеток базального слоя. Исследование роли апоптоза в потере связи кератиноцитов друг с другом может способствовать созданию новых лекарственных препаратов, блокирующих акантолиз. В связи с этим особый интерес вызывает изучение трансмембранного белка PERP, участвующего в реализации апоптоза и регуляции ряда важнейших процессов в кератиноцитах, в том числе в обеспечении межклеточной адгезии. Белок PERP относится к семейству трансмембранных белков PMP-22/gas3, которые являются структурными компонентами миелина и одновременно - регуляторами клеточного роста. В коже человека белок PERP экспрессируется на поверхности кератиноцитов. Коллективу L. Attardi удалось продемонстрировать локализацию PERP в десмосомах и подтвердить участие этого белка в адгезии клеток [7, 8]. Кроме обеспечения межклеточной адгезии PERP также регулирует пролиферацию кератиноцитов [8, 9]. показано, что апоптоз сопровождается экспрессией белка PERP. Возможно, существуют два механизма PERP-зависимого апоптоза. Во-первых, его сходство с у-субъединицей кальциевых каналов предполагает наличие порообразующей или каналобразующей активности, способствующей выходу из цитоплазматических хранилищ молекул, необходимых для индукции апоптоза. Во-вторых, не исключено, что PERP, аналогично белкам KILLER/DR5 и FAS/APO-1/CD95, является «рецептором смерти», принимающим аутокринные или паракринные сигналы [8, 10]. Ген PERP, кодирующий мембранный белок PERP, необходимый для реализации функций десмосом в коже и слизистых оболочках, был открыт в 2000 г., когда L. Attardi и соавт. обнаружили его активацию в процессе апоптоза, индуцируемую непосредственно р53 [8]. Ген PERP находится на 6-й хромосоме, содержит 19 032 пары оснований (п. о.) и включает 3 экзона, кодирующих белковую цепь PERP длиной в 193 аминокислоты. первый экзон гена PERP содержит 397 п. о., второй - 140 п. о. и третий - 3764 п. о.; общая длина белоккодирующей последовательности гена PERP составляет 579 п. о. Отмечено наличие взаимосвязи между отсутствием гена PERP и нарушением межклеточной адгезии кератиноцитов [8, 10-13]. L. Attardi и соавт. в эксперименте показано, что PERP'1- мыши погибали вскоре после рождения в результате формирования внутриэпи-дермальных пузырей на коже и слизистых оболочках. Число десмосом у PERP-/- мышей было снижено, также обнаруживалось нарушение их связи с цитоскелетом клетки [8]. Исследование кератиноцитов у мышей, лишенных белка PERP, показывает различные изменения десмосом на субклеточном уровне: происходит смещение белков десмоглеина 3, плакоглобина, нарушается нормальная структура десмосом, изменяется последовательность белков, входящих в ее состав, на-блюдется агрегация десмоплакина в цитоплазме. Кроме того, отмечается изменение электрического заря 72 к. № 5, 2013 да клеточной мембраны, нарушается механическое и биохимическое взаимодействие между клетками [14]. B. Nguyen и соавт. продемонстрировали, что под действием аутоагрессивных IgG десмоглеин 3 и PERP отделяются от цитоплазматической мембраны кера-тиноцитов человека и вместе со структурным белком десмосом плакоглобином погружаются в цитоплазму, где подвергаются разрушению в лизосомах [15]. Полученные данные указывают на возможное участие белка PERP в акантолизе. Принимая во внимание данные о реактивации гена PERP белком р53 в процессе апоптоза и о непосредственном участии в его реализации, а также сведения об активации сигнальных путей апоптоза в процессе акантолиза при истинной акантолитической пузырчатке [3, 8, 11, 12, 14, 16-19], изучение гена PERP при истинной акантолитической пузырчатке представляет значительный интерес. Представляется целесообразным изучение белоккодирующей последовательности гена PERP у больных истинной акантолитической пузырчаткой с целью выявления полиморфизмов/мутаций, возможно, ассоциированных с развитием данного заболевания и/или особенностями его клинического течения. Цель исследования: определение нуклеотидной белоккодирующей последовательности гена PERP с оценкой взаимосвязи между выявленными мутациями/полиморфизмами и развитием истинной акантолитической пузырчатки, особенностями ее течения. Материал и методы Под наблюдением находились 18 больных истинной акантолитической пузырчаткой (основная группа) и 16 здоровых добровольцев (контрольная группа). Пациентов включали в исследование согласно следующим критериям включения: подписание информированного согласия на участие в исследовании; наличие у больного истинной акантолитической пузырчатки; возраст пациента не менее 18 лет. Критерием исключения служило наличие тяжелого соматического заболевания в стадии декомпенсации. Критерием включения здоровых добровольцев в исследование служили: возраст не менее 18 лет, отсутствие заболеваний кожи на момент обследования и в течение 1 мес. до включения в исследование. Набор больных и здоровых добровольцев в исследование осуществлялся на базе ФГБУ «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии» Минздрава России. Диагноз истинной акантолитической пузырчатки устанавливался на основании данных клинической картины, результатов цитологического (наличие в мазках-отпечатках акантолитических клеток) и гистологического исследований, реакции прямой иммунофлюоресценции (учет результатов проводили с использованием конфокального лазерного сканирую щего микроскопа). Для проведения гистологического исследования у больных истинной акантолитической пузырчаткой биоптаты кожи получали из очагов поражения; для выявления отложения IgG в межклеточных пространствах эпидермиса при помощи иммунофлюо-ресцентного исследования биоптаты кожи получали в области видимо не пораженной кожи (вблизи очагов поражения). С целью изучения молекулярной структуры гена PERP использовали образцы венозной крови (в количестве 4 мл), полученные от больных истинной акан-толитической пузырчаткой и здоровых добровольцев, которые помещали в вакуумные системы типа Vacuette с фиолетовой крышкой, содержащие антикоагулянты (К2-ЭДТА или К3-ЭДТА), не ингибирующие ПЦР. Полученные образцы до проведения исследования сохраняли в низкотемпературном холодильнике при температуре не выше -20 °С. Исследование молекулярной структуры белоккодирующей последовательности гена PERP человека проводилось в несколько этапов. 1. Выделение ДНК из образцов крови, полученных от пациентов с истинной акантолитической пузырчаткой и здоровых добровольцев. 2. Амплификация белоккодирующей последовательности ДНК трех экзонов гена PERP и визуализация продуктов амплификации. 3. Проведение сиквенсной реакции и капиллярного электрофореза на генетическом анализаторе. 4. Анализ полученных данных. Выделение ДНК из образцов крови проводили с помощью набора реагентов GeneJET (фирма Fermentas, Литва) в соответствии с инструкцией производителя. Нуклеотидная последовательность гена PERP была найдена в базе данных GenBank под номером ID: 64065. Праймеры для полимеразной цепной реакции подбирались с помощью программы Oligo6. Для проведения ПЦР использовали набор с HS Taq ДНК-полимеразой (фирма «Евроген», Россия) в соответствии с инструкцией производителя. Характеристика праймеров, ПЦР-продуктов, а также условия проведения амплификации трех экзонов гена PERP представлены в табл. 1. Для амплификации 2-го экзона гена PERP использовали подход Touchdown («ступенчатая ПЦР») с каскадным понижением температуры на этапах отжига праймеров. Применение варианта ПЦР Touchdown позволило снизить количество неспецифического продукта в реакции. Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР проводили в 2% агарозном геле. Результаты реакций амплификации оценивали с помощью трансиллюминатора с фотокамерой для фотографирования гелей в ультрафиолетовом свете с длиной волны 310 нм. Полученные ПЦР-продукты осаждали с помощью ферментов: EcoI (Fermentas, Литва) и щелочная фос- Вестник дерматологии и венерологии Научные исследования л 73 Табл а 1 Последовательности праймеров для амплификации белоккодирующей последовательности ДНК иц трех экзонов гена PERP. Условия проведения амплификации, размер ПЦР-продуктов Экзон Праймеры Условия амплификации Размер ПЦР-продуктов 1-й Perp1ex for CT CTGAGT CACCGGAAT CTAG 95 °С - 3 мин.; 609 п.о. Perp1ex rev TT CTGTTT CTGAGCTTGGTGTT 35 циклов: 95 °С - 10 сек.; 62 °С - 10 сек.; 72 °С - 25 сек.; 72 °С - 3 мин. 2-й Perp2ex rev T CCGAGAACAGATTAGAAACTG Perp2ex for CCTTAAAATATGGAGATGCTCAA 95 °C - 3 мин. 5 циклов: 95 °С - 10 сек. 68 °С - 10 сек. 72 °С - 25 сек. 5 циклов: 95 °С - 10 сек. 64 °С - 10 сек. 72 °С - 25 сек. 25 циклов: 95 °С - 10 сек. 62 °С - 10 сек. 72 °С - 25 сек. 72 °С - 3 мин. 419 п.о. 3-й Perp3ex for GCAGAAACTTGGTGGAAGGA 95 °C - 3 мин.; 406 п.о. Perp3ex rev GTTCAAAGTCGCCTGGAGAA 35 циклов: 95 °С - 10 сек.; 62 °С - 10 сек.; 72 °С - 25 сек.; 72 °С - 3 мин. фатаза SAP (Fermentas, Литва). В реакции использовали 0,5 мкл экзонуклеазы (20 ед. в мкл), 1 мкл фос-фатазы (1 ед. в мкл) и 5 мкл пЦР-продукта. Реакцию осаждения пЦР-продуктов проводили при следующих условиях: 1) 37 °С - 30 мин., 2) 90 °С - 20 мин. продукты реакции осаждения использовали при постановке сиквенсной реакции. проведение сиквенсной реакции осуществляли с использованием набора реагентов для секвенирова-ния ДНК Big Dye Terminator v3.1 Sequencing RR-100 (фирма Applied Biosystems, США) в соответствии с инструкцией производителя. В качестве праймеров для сиквенсной реакции использовали праймеры, представленные в табл. 1. продукты сиквенсной реакции осаждали спиртом, после чего проводили их электрофоретическое разделение с использованием генетического анализатора 3130 Genetic Analyzer (фирма Applied Biosystems, США). Анализ нуклеотидных последовательностей экзонов гена PERP, полученных в результате секве-нирования, проводили с использованием программы MEGA5 и пакета программ BLAST (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/BLAST/). Результаты проведенных исследований оценивались путем статистической обработки: частота встречаемости аллелей гена PERP определялась путем прямого расчета. Достоверность различий между ча стотами встречаемости признаков в двух сравниваемых группах обследованных (больных пузырчаткой и здоровых) оценивалась с применением четырехпольной таблицы, критерия х2и показателя отношения шансов (Odds Ratio - OR), рассчитываемых при помощи калькулятора, находящегося в открытом доступе на сайте библиотеки Meta Numerics (http://www. meta-numerics.net/Samples/ContingencyCalculator. aspx). Результаты исследований Клиническая характеристика выборки В обследуемую выборку были включены 18 больных с подтвержденным диагнозом истинной акантолитической пузырчатки, в том числе 2 (11,1%) женщины и 16 (88,9%) мужчин. Возраст больных истинной акан-толитической пузырчаткой составлял от 18 до 76 лет (в среднем 54,22 ± 17,6 года). Следует отметить, что 1 (50%) женщина и 13 (81,3%) мужчин заболели в трудоспособном возрасте. Среди больных истинной акантолитической пузырчаткой у 11 (61,1%) была вульгарная пузырчатка, у 7 (38,9%) - себорейная. Из 18 больных с дебютом заболевания были госпитализированы 7 (38,9%) пациентов, с рецидивом заболевания - 11 (61,1%). Возраст больных при дебюте истинной акантолитической пузырчатки варьировал от 17 до 75 лет (в сред 74 к. № 5, 2013 Рисунок Вульгарная пузырчатка у больной Г. с преимущественным поражением красной каймы губ (а) и слизистой оболочки полости рта (б) нем 51,9 ± 17,3 года). Длительность заболевания составляла от 1 до 125 мес. (в среднем 27,2 мес.). После появления первых признаков заболевания диагноз истинной акантолитической пузырчатки был установлен в сроки от 1 мес. до 4,5 лет, в среднем через 18,8 ± 16,96 мес. У большинства больных патологический процесс локализовался на коже (n = 6; 33,3%) с одновременным вовлечением слизистых оболочек у 10 (55,6%) больных истинной акантолитической пузырчаткой. У 2 (11,1%) больных отмечалось поражение только слизистой оболочки полости рта без клинических проявлений на коже. После дебюта заболевания высыпания носили ограниченный характер и локализовались только на слизистых оболочках полости рта или только на коже туловища или волосистой части головы (рис.). Через 1 месяц - 4 года высыпания у пациентов принимали распространенный характер. Площадь поражения кожных покровов при этом составляла от 1 до 18% (в среднем - 5,11%). При обследовании больных выявлена ассоциация истинной акантолитической пузырчатки с другими аутоиммунными заболеваниями, в частности аутоиммунный тиреоидит отмечен у 6 (33,3%) больных, ревматоидный артрит - у 1 (5,6%). У 14 больных (77,8%) истинная акантолитическая пузырчатка протекала на фоне патологии сердечно-сосудистой системы (гипертоническая болезнь, ишемическая болезнь сердца), у 15 (83,3%) - сочеталась с заболеваниями желудочно-кишечного тракта (хронический холецистит, панкреатит, гастрит, дуоденит). Все обследованные пациенты получали лечение глюкокортикостероидными препаратами, длительность терапии составляла от 1 до 37 месяцев. Следует отметить, что у 13 (72,2%) больных регистрировались осложнения глюкокортикостероидной терапии: сахарный диабет (n = 4; 22,2%), надпочечниковая недостаточность (n = 3; 16,7%), нарушение толерантности к глюкозе (n = 8; 44,4%), артериальная гипертензия (n = 8; 44,4%). При этом сроки развития осложнений составляли от 1 до 11 месяцев от начала системной терапии глюкокортикостероидными препаратами (в среднем 6 мес.). Контрольную группу составили 16 здоровых добровольцев: 4 женщины (25%) и 12 мужчин (75%). Обследованные группы были сопоставимы по полу и возрасту. Результаты изучения белоккодирующей последовательности гена PERP методом секвенирования В результате анализа белоккодирующей нуклеотидной последовательности гена PERP у больных истинной акантолитической пузырчаткой и здоровых добровольцев в 1-м и 2-м экзонах мутаций/полиморфизмов обнаружено не было, в третьем экзоне гена PERP были обнаружены два SNP1. В базе данных NCBI выявленные SNP описаны и обозначаются как rs648802 (C611G) и rs648396 (T675C). Данные SNP являются полиморфизмами, поскольку встречаются в популяции с частотой более чем 1%. В случае полиморфизма rs648802 происходит замена нуклеотида С (цитозина) 1 Single nucleotide polymorphism, SNP - однонуклеотидный полиморфизм - отличия последовательности ДНК размером в один нуклеотид (A, T G или C) в геноме (или в другой сравниваемой последовательности). Вестник дерматологии и венерологии Научные исследования л 75 Таблица 2 Результаты секвенирования белоккодирующих последовательностей экзонов гена PERP у больных акантолитической пузырчаткой и здоровых добровольцев Больные истинной акантолитической пузырчаткой, № п/п Определяемые генотипы Здоровые, № п/п Определяемые генотипы rs648802 (полиморфизм C/G в положении 611 3-го экзона гена PERP) rs648396 (полиморфизм T/C в положении 675 3-го экзона гена PERP) rs648802 (полиморфизм C/G в положении 611 3-го экзона гена PERP) rs648396 (полиморфизм T/C в положении 675 3-го экзона гена PERP) 1 GG CC 1 CG TC 2 CG TC 2 CC TT 3 CG TC 3 CC TT 4 cc TT 4 GG CC 5 GG CC 5 GG CC 6 CG TC 6 GG CC 7 GG CC 7 CG TC 8 CG TC 8 CG TC 9 CG TC 9 CG TC 10 CG TC 10 CC TT 11 CG TC 11 GG CC 12 CG TC 12 CC TT 13 GG CC 13 CC TT 14 CG TC 14 GG CC 15 GG CC 15 CG TC 16 CG TC 16 GG CC 17 GG CC 18 GG CC на G (гуанин) в положении 611 нуклеотидной цепи, что приводит к замене пролина на аргинин в положении 143 белковой цепи PERP. Результаты изучения генотипов PERP больных акантолитической пузырчаткой и здоровых добровольцев представлены в табл. 2. У здоровых добровольцев частота выявления С/G генотипа rs648802 в 3-м экзоне гена PERP составила 31,3% (у 5 из 16), частота генотипа G/G rs648802 составила 37,4% (у 6 из 16), частота генотипа С/С rs648802 определялась в 31,3% случаев (у 5 из 16). Частота выявления Т/С генотипа rs648396 в 3-м экзоне гена PERP составила 31,3% (у 5 из 16), частота генотипа С/С rs648396 составила 37,4% (у 6 из 16), частота генотипа Т/Т rs648396 определялась в 31,3% случаев (у 5 из 16). У больных истинной акантолитической пузырчаткой частота выявления С/G генотипа rs648802 в 3-м экзоне гена PERP составила 55,5% (у 10 из 18), частота генотипа G/G rs648802 составила 38,9% (у 7 из 18), частота генотипа С/С rs648802 определялась в 5,6% случаев (у 1 из 18). Частота выявления Т/С генотипа rs648396 гена PERP составила 55,5% (у 10 из 18), частота генотипа С/С rs648396 составила 38,9% (у 7 из 18), частота генотипа Т/Т определялась в 5,6% случаев (у 1 из 18). По данным секвенирования изучаемые полиморфизмы rs648802 и rs648396 наследуются сцеплен-но: G(rs648802) с C(rs648396), а также C(rs648802) с T(rs648396). Проведено сравнение частоты встречаемости генотипов у больных истинной акантолитической пузырчаткой и здоровых добровольцев. Несмотря на небольшой размер выборки сравниваемых групп больных истинной акантолитической пузырчаткой и здоровых добровольцев, частота встречаемости гомозиготных генотипов «дикого» типа выявленных полиморфизмов (С/С генотип rs648802 и Т/Т генотип rs648396) у здоровых добровольцев достоверно превысила частоту встречаемости данных генотипов у больных (при расчете данных с применением четырехпольной таблицы и критерия х2 получены значения: х2 = 3,85; p = 0,049, 76 к. № 5, 2013 Odds Ratio = 0,13; a = 0,15; С195% = 0,17; 0,42). Вместе с тем у больных истинной акантолитической пузырчаткой отмечена тенденция к более частому выявлению мутантных гетерозиготных генотипов С/G rs648802 и Т/C rs648396 (при расчете данных с применением четырехпольной таблицы и критерия х2 получены значения: х2 = 2,86; p = 0,09, Odds Ratio = 3,25; a = 2,30; С195% = -1,26; 7,76,). при сравнении частот встречаемости генотипов у больных различными формами пузырчатки (вульгарной и себорейной) у мужчин и женщин, а также у больных с манифестацией высыпаний на слизистых оболочках и больных с манифестацией заболевания на коже, у больных с поражением только слизистых оболочек, только кожных покровов или сочетанным поражением слизистых оболочек и кожных покровов статистически значимых различий обнаружено не было. при сравнении частот встречаемости генотипов у больных в зависимости от возраста, в котором возникли первые высыпания, было выявлено, что гомозиготные мутантные генотипы выявленных полиморфизмов (G/G генотип rs648802 и С/С генотип rs648396) чаще выявлялись у больных с более ранним началом заболевания (41-60 лет) (х2 = 5; p = 0,025), а гетерозиготные генотипы (С/G генотип rs648802 и T/С генотип rs648396) - при манифестации заболевания в возрасте 61 года и старше (х2 = 6,6; p = 0,01). Заключение Таким образом, в результате анализа белоккоди-рующей нуклеотидной последовательности гена PERP впервые на российской выборке больных истинной акантолитической пузырчаткой и здоровых добровольцев в третьем экзоне гена PERP были выявлены два полиморфизма: rs648802 (несинонимичная замена нуклеотида, то есть приводящая к замене аминокислоты в кодируемом белке) и rs648396 (синонимичная замена нуклеотида, не приводящая к замене аминокислоты в белковой цепи). Наблюдаемая нуклеотидная замена (rs648802) является значимой, так как приводит к изменению аминокислотной последовательности белка PERP и, следовательно, к изменению его структуры и, возможно, функции. Биологическое значение полиморфизма rs648802 в гене PERP, приводящего к замене аминокислоты в белке PERP, может заключаться в том, что наличие G-аллеля в rs648802 сопровождается усилением функции белка PERP, и, следовательно - активацией процессов апоптоза [20]. при истинной акантолитической пузырчатке показана активация апоптотических сигнальных путей в эпидермисе в процессе акантолиза [21]. поэтому если наличие G-аллеля в положении 611 третьего эк-зона гена PERP связано с усилением функции белка PERP, то у носителей полиморфного гена PERP может усугубляться поражение кожи и/или слизистых оболочек. Это предположение косвенно подтверждается результатами настоящего исследования, показавшими более высокую частоту встречаемости генотипа «дикого» типа у здоровых добровольцев по сравнению с больными истинной акантолитической пузырчаткой, тенденцию к более частому выявлению мутантных гетерозиготных генотипов С/G rs648802 и Т/C rs648396 у больных истинной акантолитической пузырчаткой, более раннюю манифестацию заболевания у носителей гомозиготного полиморфного генотипа (G/G генотип rs648802 и С/С генотип rs648396) и более позднее начало пузырчатки у носителей гетерозиготного полиморфного генотипа (С/G генотип rs648802 и T/С генотип rs648396). Идентификация полиморфного генотипа в третьем экзоне гена PERP методом секвенирования или другими молекулярными методами (например пЦР-пФРФ) может быть использована с целью прогнозирования сроков манифестации истинной акантолитической пузырчатки у генетически предрасположенных пациентов. Однако следует подчеркнуть необходимость уточнения полученных предварительных результатов на более крупной выборке больных истинной аканто-литической пузырчаткой и здоровых добровольцев.

About the authors

A A KUBANOV

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology Ministry of Healthcare of the Russian Federation; Russian Medical Academy of Postgraduate Studies, Ministry of Health of the Russian Federation

A V MICHENKO

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology Ministry of Healthcare of the Russian Federation

T V ABRAMOVA

Russian Medical Academy of Postgraduate Studies, Ministry of Health of the Russian Federation

Email: abtava@mail.ru

O S KOZHUSHNAYA

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology Ministry of Healthcare of the Russian Federation

N V FRIGO

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology Ministry of Healthcare of the Russian Federation; Russian Medical Academy of Postgraduate Studies, Ministry of Health of the Russian Federation

L F ZNAMENSKAYA

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology Ministry of Healthcare of the Russian Federation

References

Supplementary files