Determination of molecular types and resistance to macrolides in  Treponema pallidum  isolates isolated in the Russian Federation

Olga A. Obraztsova; Образцова Ольга Анатольевна; Kseniya M. Lagun; Лагун Ксения Михайловна; Georgii L. Katunin; Катунин Георгий Леонидович; Marina V. Shpilevaya; Шпилевая Марина Валентиновна; Nikita Y. Nosov; Носов Никита Юрьевич

doi:10.25208/vdv15827

Determination of molecular types and resistance to macrolides in Treponema pallidum isolates isolated in the Russian Federation

Authors: Obraztsova O.A.¹, Lagun K.M.¹, Katunin G.L.¹, Shpilevaya M.V.¹, Nosov N.Y.¹
Affiliations:
1. State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology
Issue: Vol 100, No 2 (2024)
Pages: 52-58
Section: ORIGINAL STUDIES
Submitted: 26.09.2023
Accepted: 09.04.2024
Published: 20.05.2024
URL: https://vestnikdv.ru/jour/article/view/15827
DOI: https://doi.org/10.25208/vdv15827
ID: 15827

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Background. The number of syphilis cases in the Russian Federation increased significantly in 2022. Control of heterogeneity of Treponema pallidum subtypes is important to monitor the emergence and spread of antibiotic-resistant strains

Aims. To determine molecular subtypes and resistance to macrolides in T. pallidum isolates isolated in the Russian Federation in 2022.

Methods. We analyzed DNA isolated from 49 samples of clinical material obtained from patients from dermatovenerological treatment and prevention facilities in three federal districts (CFD, SFD, SCFD) of the Russian Federation in 2022 with diagnoses of primary syphilis and secondary syphilis. T. pallidum DNA isolation and confirmation of the presence of genetic material were performed according to the existing algorithms. To search for genetic determinants of resistance to macrolides, a fragment of the 23S rRNA gene was analyzed. Primary decoding of nucleotide sequences was performed in Sequencing Analysis 5.3.1. Mega 11 program was used to align the analyzed fragments of target genes to T. pallidum reference sequences.

Results. In 2022, three subtypes of T. pallidum were identified in the territory of the represented federal districts of the Russian Federation: 14d/f, 14d/g, 14d/d with continued dominance of subtype 14d/f. The macrolide-resistant subtype 14d/d was identified in two federal districts, which is new for the Russian Federation.

Conclusions. The population of T. pallidum continues to expand in the Russian Federation, including the emergence of azithromycin-resistant strains. The data obtained confirm the need for continuous monitoring of circulating strains and may facilitate understanding of their geographic distribution.

Keywords

Treponema pallidum, macrolides, mutation A2058G, subtype

Full Text

Обоснование

Сифилис, вызываемый Treponema pallidum subsp. Pallidum (T. pallidum), является системным инфекционным заболеванием, передающимся половым путем. По данным официального государственного статистического наблюдения, в Российской Федерации показатель заболеваемости всеми формами сифилиса в 2019 г. составил 15,0 случая на 100 тыс. населения; в 2020 г. — 10,5; в 2021 г. — 14,5; в 2022 г. — 18,9 случая. Таким образом, за 2021–2022 гг. был зарегистрирован значительный рост заболеваемости сифилисом в целом по стране [1].

Важным инструментом для определения разнообразия и антибиотикоустойчивости циркулирующих изолятов T. pallidum является молекулярное типирование. В 1998 г. Центры по контролю и профилактике заболеваний США (CDC) впервые представили схему типирования, основанную на определении количества повторов длиной 60 п.н. в гене arp и различий последовательностей в генах tprII [2], которая впоследствии была дополнена секвенированием участка гена tp0548 [3]. Результат молекулярно-генетического типирования отдельного клинического изолята выражается тройным цифровым и буквенным обозначением (например, 14a/a), характеризующим обнаруженные у него варианты генов arp, tprII и tp0548. По результатам исследований, эндемичные для Российской Федерации субтипы T. pallidum относятся к линии Street Strain-14 (SS14) [4], которая занимает лидирующее положение в мире [5, 6]. В интервале 2014–2021 гг. на территории Российской Федерации идентифицировано восемь молекулярных субтипов T. pallidum — 14d/f, 14d/g, 14b/f, 14c/f, 14i/f, 9d/f, 14b/g и 14e/f с устойчивым доминированием субтипа 14d/f [7].

В соответствии с российскими клиническими рекомендациями препаратами первой линии для лечения сифилиса выступают препараты пенициллина [8]. Однако, несмотря на доказанную эффективность, лечение сифилитической инфекции данными препаратами ограничивается возможным развитием аллергических реакций [9–11]. В 1990-х годах для лечения больных ранними формами сифилиса начали применять азитромицин — антибиотик группы макролидов, который первоначально рассматривался как удобная альтернатива терапевтическому варианту бензатин бензилпенициллина G. Азитромицин прост в применении, не требует инвазивных процедур, имеет мало побочных эффектов и может использоваться в ускоренной партнерской терапии сифилиса [12]. В Российской Федерации с 1993 по 2003 г. азитромицин был включен в перечень препаратов резерва для лечения ранних манифестных форм сифилиса при непереносимости пенициллина и других препаратов резерва — доксициклина и цефалоспорина [13–15]. В связи с растущей устойчивостью T. pallidum к макролидам [16, 17] из последующих российских рекомендаций по лечению сифилиса азитромицин был удален. В настоящее время некоторые зарубежные руководства, в частности Центров по контролю и профилактике заболеваний США (CDC), включают данный антибиотик в качестве препарата второй линии для терапии ранних форм сифилиса [18].

Было показано, что существует тесная связь между устойчивостью к макролидам и мутациями A2058G и A2059G в 23S рРНК T. pallidum [19–21]. Особенностью T. pallidum является невозможность лабораторного тестирования ее антибиотикочувствительности ввиду некультивируемости возбудителя сифилиса, что обусловливает применение молекулярно-генетических методов исследования, позволяющих всесторонне изучить генетические детерминанты резистентности. В интервале 2014–2021 гг. на территории Российской Федерации идентифицированы три субтипа — 14d/g, 14b/g и 14b/f, несущие ассоциированную с резистентностью к азитромицину мутацию A2058G [7, 22].

Цель данной работы — исследовать молекулярные типы и устойчивость к макролидам у изолятов T. pallidum, выделенных на территории Российской Федерации в 2022 г.

Методы

В 2022 г. было получено 49 изолятов T. pallidum от пациентов лечебно-профилактических учреждений дерматовенерологического профиля трех федеральных округов Российской Федерации, а именно 24 — из Сибирского, 23 — из Центрального и 2 — из Северо-Кавказского. Диагноз «сифилис» был установлен на основании клинических данных и лабораторных тестов: теста быстрых плазменных реагинов (РПР), реакции пассивной гемагглютинации (РПГА), иммуноферментного анализа (ИФА) [23]. Среди больных сифилисом, от которых были получены клинические изоляты (отделяемое эрозивно-язвенных элементов), содержавшие бледную трепонему, было 35 мужчин и 14 женщин в возрасте от 16 до 76 лет. По диагнозу пациенты распределялись следующим образом: первичный сифилис (А51.1 по МКБ-10) был диагностирован у 14 пациентов, вторичный сифилис (А.51.3) — у 34, первичный сифилис других локализаций (А51.2) — у 1 пациента.

Выделение ДНК из образцов клинического материала проводили с использованием набора реагентов «Проба-НК» («ДНК-технология», Россия) согласно инструкции производителя. Присутствие генетического материала T. pallidum в образцах клинического материала подтверждалось методом ПЦР с праймерами к видоспецифичному гену polA, кодирующему ДНК-полимеразу I данного микроорганизма (табл. 1) [24].

Таблица 1. Последовательности праймеров, использованных для амплификации целевых генов T. pallidum

Table 1. Primer sequences used for amplification of T. pallidum target genes

Ген	Название праймера	Нуклеотидная последовательность
arp	ARP-1	5’-ATCTTTGCCGTCCCGTGTGC-3’
arp	ARP-2	5’-CCGAGTGGGATGGCTGCTTC-3’
tprII	A-1	5’-ACTGGCTCTGCCACACTTGA-3’
	B-2	5’-CTACCAGGAGAGGGTGACGC-3’
	IP-6	5’-CAGGTTTTGCCGTTAAGC-3’
	IP-7	5’-AATCAAGGGAGAATACCGTC-3’
tp0548	tp0548 sense	5’-GGTCCCTATGATATCGTGTTCG-3’
tp0548	tp0548 antisense	5’-GTCATGGATCTGCGAGTGG-3’
23 S	23 Sf	5’-GTCTCCCACCTATACTACACAT -3’
23 S	23 Sr	5’-GGAGAGGTTCGTGGTAACACA -3’

Молекулярное типирование образцов с подтвержденным наличием генетического материала T. pallidum проводили в соответствии с алгоритмом, рекомендованным Центром контроля и профилактики заболеваний США (Center for Disease Control and Prevention, Druid Hills, Atlanta, Georgia). Алгоритм проведения и порядок оценки результатов метода описаны ранее [25]. Амплификацию генов T. pallidum осуществляли на основе пар праймеров [24] с использованием ДНК-амплификатора Т100 Thermal Cycler (Bio-Rad, США). Очистка ПЦР-продукта после первого этапа амплификации проведена с использованием набора QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Германия). Очищенный ПЦР-продукт был использован для второго этапа амплификации с применением меченых терминирующих нуклеотидов из набора реагентов Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США). Осажденные продукты ПЦР использовали для проведения секвенирования вариабельного фрагмента гена 23S рРНК на приборе 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) с применением программного обеспечения 3130 Data Collection v. 3.0 [7]. Первичная расшифровка нуклеотидных последовательностей проведена в программе Sequencing Analysis 5.3.1. Для выравнивания анализируемых фрагментов целевых генов на референсные сиквенсы T. pallidum использовали программу Mega 5.

Результаты

В 49 клинических образцах методом ПЦР с праймерами к гену polA было подтверждено присутствие ДНК T. pallidum. Молекулярное типирование изолятов по генам arp, tpr и tp0548 позволило идентифицировать полный молекулярный субтип каждого изолята. Были выявлены по одному варианту генов arp (вариант 14) и tprII (вариант d) и 3 варианта гена tp0548 (варианты d, f, g). Таким образом, в проанализированной популяции определены три молекулярных субтипа: 14d/f (32 штамма, 65%), 14d/d (10 штаммов, 20%) и 14d/g (7 штаммов, 15%), из которых 14d/d обнаружен впервые (рис. 1).

Рис. 1. Варианты нуклеотидных последовательностей в гене tp0548 T. pallidum

Fig. 1. Nucleotide sequence variants in the tp0548 gene of T. pallidum

Транзиция A2058G с доказанной ролью в обеспечении высокого уровня резистентности к макролидным антибиотикам оказалась ассоциирована с субтипами 14d/d и 14d/g (всего 17 штаммов, 35%). Распределение изолятов по федеральным округам представлено в табл. 2.

Таблица 2. Распределение субтипов T. pallidum по федеральным округам

Table 2. Distribution of T. pallidum subtypes by federal districts

Федеральный округ	Субъект РФ	Количество изолятов по субтипам
Федеральный округ	Субъект РФ	14d/f	14d/g*	14d/d*
Северо-Кавказский	г. Ставрополь	—	—	2
Сибирский	г. Кызыл	24	—	—
Центральный	г. Москва	8	6	8
Центральный	Калужская область	—	1	—

*Субтипы, содержащие мутацию устойчивости к макролидам.

*Subtypes containing a macrolide resistance mutation.

Обсуждение

Ввиду того, что T. pallidum является некультивируемым патогеном и не растет на питательных средах, изучение антибиотикорезистентности данного микроорганизма проводится молекулярно-генетическими методами путем определения известных и вероятных генетических детерминант резистентности. Особый интерес представляет поиск детерминант устойчивости T. pallidum к антибактериальным препаратам широкого спектра действия, применяемым в качестве альтернативной схемы терапии при непереносимости пенициллинов, отмеченной у 8–12% популяции [9–11]. В литературе упоминаются две мутации, идентифицированные в гене 23S рРНК. Первая — A2058G — определяет устойчивость T. pallidum к макролидам с 14-членным (эритромицин, рокситриомицин, кларитромицин) и 15-членным (азитромицин) лактоновым кольцом [5]. Вторая мутация — A2059G — обеспечивает устойчивость одновременно к 14-, 15- и 16-членным (спирамицин, тилозин) макролидам [6]. Ограничением настоящего исследования является невозможность изучить клинические проявления выявленной устойчивости, так как азитромицин исключен из федеральных клинических рекомендаций по ведению больных сифилисом. Тем не менее полученные данные об устойчивости к макролидам на основании проведенного молекулярного типирования клинических изолятов позволили осуществить анализ российской популяции T. pallidum.

В 2022 г. на территории представленных федеральных округов идентифицированы три субтипа T. pallidum. Можно отметить продолжающееся доминирование эндемичного для Российской Федерации субтипа 14d/f, сохраняющего чувствительность к макролидам. Устойчивый к макролидам субтип 14d/g ранее уже обнаруживался в Сибирском и Центральном федеральных округах [7, 22]. В 2022 г. в Центральном (преимущественно) и Северо-Кавказском федеральных округах появился новый для Российской Федерации устойчивый к макролидам субтип 14d/d. Данный субтип T. pallidum никогда не был преобладающим ни в одной стране, однако является одним из наиболее распространенных в Аргентине [26], редко встречается в Чешской Республике [22], спорадически обнаруживается во Франции [27] и Австралии [28]. В Бразилии выделены изоляты T. pallidum данного субтипа с мутацией устойчивости к макролидам A2058G [29].

Данные исследования свидетельствуют о постоянном расширении популяции T. pallidum на территории Российской Федерации, в том числе за счет появления азитромицин-устойчивых штаммов. Так, в 2013 г. несущие ассоциированную с резистентностью к азитромицину мутацию A2058G в гене 23S рРНК изоляты T. pallidum принадлежали субтипам 14d/g и 14b/f [23], в 2016 г. — к субтипу 14b/g [12], в 2022 г. — к субтипу 14d/d. Кроме того, в 2016 и 2017 гг. в Сибирском федеральном округе были идентифицированы изоляты 14b/g и 14e/f, не имеющие мутации устойчивости к макролидам [12]. По данным Федеральной службы государственной статистики, в 2022 г. в Москве выявлено в 2 раза больше больных с впервые в жизни установленным диагнозом сифилиса, чем годом ранее [1]. Одной из причин роста заболеваемости является увеличение миграционных потоков. Менее очевидной причиной может быть бесконтрольное использование антибиотиков, маскирующее симптомы заболевания.

Этическая экспертиза

В рамках нашего исследования не задействованы пациенты, не осуществляется вмешательство в ход лечения. В исследовании используются исключительно образцы биоматериала из субъектов РФ. Полученная информация не позволяет непосредственно или косвенно идентифицировать пациентов и не может повлечь за собой риск уголовной или гражданской ответственности пациентов, нанести ущерб их финансовому положению, положению на работе или репутации.

Заключение

Результаты молекулярного типирования клинических изолятов T. pallidum, проведенного в 2022 г., подтвердили существующую тенденцию: в 2022 г. среди образцов T. pallidum, циркулировавших на территории Российской Федерации, доминировал молекулярный тип 14d/f, другие субтипы встречались реже; все образцы с субтипом гена tp 0548 «g» несли в себе доминанту резистентности к макролидам A2058G.

Поскольку Россия относится к географическим регионам с низкой распространенностью устойчивости к макролидам, появление изолятов, содержащих маркеры устойчивости к азитромицину, можно отнести за счет трансграничного переноса, связанного с трудовой миграцией или туризмом из определенного географического региона. Таким образом, проведение непрерывного мониторинга российской популяции T. pallidum может облегчить понимание географического распространения инфекции и антибиотикорезистентности штаммов T. pallidum.