Determination of molecular types and resistance to macrolides in Treponema pallidum isolates isolated in the Russian Federation in 2022.

Olga A Obraztsova; Образцова Ольга Анатольевна; Kseniya M. Lagun; Лагун Ксения Михайловна; Georgii L. Katunin; Катунин Георгий Леонидович; Marina V Shpilevaya; Шпилевая Марина Валентиновна; Nikita Yu Nosov; Носов Никита Юрьевич

doi:10.25208/vdv15827

Determination of molecular types and resistance to macrolides in Treponema pallidum isolates isolated in the Russian Federation in 2022.

Authors: Obraztsova O.A¹, Lagun K.M.¹, Katunin G.L.¹, Shpilevaya M.V¹, Nosov N.Y.¹
Affiliations:
1. Federal State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology
Section: ORIGINAL STUDIES
URL: https://vestnikdv.ru/jour/article/view/15827
DOI: https://doi.org/10.25208/vdv15827
ID: 15827

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Background: The number of syphilis cases in the Russian Federation increased significantly in 2022. Control of heterogeneity of Treponema pallidum subtypes is important to monitor the emergence and spread of antibiotic-resistant strains

Aims: To determine molecular subtypes and resistance to macrolides in Treponema pallidum isolates isolated in the Russian Federation in 2022.

Materials and methods: We analyzed DNA isolated from 49 samples of clinical material obtained from patients from dermatovenerological treatment and prevention facilities in three federal districts (CFD, SFD, SCFD) of the Russian Federation in 2022 with diagnoses of primary syphilis and secondary syphilis. T. pallidum DNA isolation and confirmation of the presence of genetic material were performed according to the existing algorithms. To search for genetic determinants of resistance to macrolides, a fragment of the 23S rRNA gene was analyzed. Primary decoding of nucleotide sequences was performed in Sequencing Analysis 5.3.1. Mega 11 program was used to align the analyzed fragments of target genes to T.pallidum reference sequences.

Results: In 2022, three subtypes of T.pallidum were identified in the territory of the represented federal districts of the Russian Federation: 14d/f, 14d/g, 14 d/d with continued dominance of subtype 14d/f. The macrolide-resistant subtype 14 d/d was identified in two federal districts, which is new for the Russian Federation.

Conclusions: The population of T. pallidum continues to expand in the Russian Federation, including the emergence of azithromycin-resistant strains. The data obtained confirm the need for continuous monitoring of circulating strains and may facilitate understanding of their geographic distribution.

Keywords

Treponema pallidum, macrolides, mutation A2058G, subtype.

Full Text

Сифилис, вызываемый бледной трепонемой Treponema pallidum subsp. pallidum, является системным инфекционным заболеванием, передающимся преимущественно половым путем. По данным официального государственного статистического наблюдения в Российской Федерации показатель заболеваемости всеми формами сифилиса в 2019 году составил 15,0 случаев на 100 тыс. населения, в 2020 году – 10,5 случаев, в 2021 году – 14,5 случаев, в 2022 году – 18,9 случаев, таким образом, за 2021-2022 годы был зарегистрирован значительный рост заболеваемости сифилисом в целом по стране [1].

Важным инструментом для характеристики циркулирующих изолятов T. pallidum - определения их разнообразия и антибиотикоустойчивости - является молекулярное типирование. В 1998 году Центры по контролю и профилактике заболеваний (CDC) впервые представили схему типирования, основанную на определении количества повторов длиной 60 п.н. в гене arp и различий последовательностей в генах tprII [2], которая впоследствии была дополнена секвенированием участка гена tp0548 [3]. Результат молекулярно-генетического типирования отдельного клинического изолята выражается тройным цифровым и буквенным обозначением (например, 14 a/a), характеризующим обнаруженные у него варианты генов arp, tprII и tp0548. По результатам исследований, эндемичные для Российской Федерации субтипы T. pallidum относятся к линии Street Strain-14 (SS14) [4], которая занимает лидирующее положение в мире [5, 6]. В интервале 2014 – 2021 гг на территории Российской Федерации идентифицированы 8 молекулярных субтипов T.pallidum – 14d/f, 14d/g, 14b/f, 14c/f, 14i/f, 9d/f, 14b/g и 14e/f с устойчивым доминированием субтипа 14d/f [7].

В соответствии с Российскими клиническими рекомендациями препаратами первой линии для лечения сифилиса являются препараты пенициллина. Однако, несмотря на доказанную эффективность, лечение сифилитической инфекции данными препаратами ограничивается возможным развитием аллергических реакций. В 90-х годах XX века для лечения больных ранними формами сифилиса начали применять азитромицин – антибиотик группы макролидов, который первоначально рассматривался как удобная альтернатива терапевтическому варианту бензатин бензилпенициллина G. Азитромицин прост в применении, не требует инвазивных процедур, имеет мало побочных эффектов и может использоваться в ускоренной партнерской терапии сифилиса [8]. В Российской Федерации с 1993 по 2003 гг. азитромицин был включен в перечень препаратов резерва для лечения ранних манифестных форм сифилиса при непереносимости пенициллина и других препаратов резерва – доксициклина и цефалоспорина [9 - 11]. В связи с растущей устойчивостью T. pallidum к макролидам [12, 13] из последующих российских рекомендаций по лечению сифилиса азитромицин был удалён. В настоящее время некоторые зарубежные руководства, в частности центров по контролю и профилактике заболеваний США (CDC), включают данный антибиотик в качестве препарата второй линии для терапии ранних форм сифилиса [14].

Было показано, что существует тесная связь между устойчивостью к макролидам и мутациями A2058G и A2059G в 23S рРНК T. pallidum [15, 16]. В интервале 2014 – 2021 гг на территории Российской Федерации идентифицированы три субтипа - 14 d/g, 14 b/g и 14 b/f, несущие ассоциированную с резистентностью к азитромицину мутацию A2058G [7, 17]. Цель данной работы – исследовать молекулярные типы и устойчивость к макролидам у изолятов Treponema pallidum, выделенных на территории Российской Федерации в 2022 г.

Методы

В 2022 г было получено 49 изолятов T.pallidum от пациентов лечебно-профилактических учреждений дерматовенерологического профиля трёх федеральных округов (ФО) Российской Федерации – Сибирского (СФО), Северо-Кавказского (СКФО) и Центрального (ЦФО). Диагноз «сифилис» был установлен на основании клинических данных и лабораторных тестов: теста быстрых плазменных реагинов (РПР), реакции пассивной гемагглютинации (РПГА), иммуноферментного анализа (ИФА) [18, 19]. Среди больных сифилисом, от которых были получены клинические изоляты, содержавшие бледную трепонему, было 35 мужчин и 14 женщин в возрасте от 16 до 76 лет. По диагнозу пациенты распределялись следующим образом: первичный сифилис (А51.1 по МКБ-10) был диагностирован у 14 пациентов, вторичный сифилис (А.51.3) — у 34 пациентов, первичный сифилис других локализаций (А51.2) – у 1 пациента.

Выделение ДНК из образцов клинического материала проводили с использованием набора реагентов «Проба-НК» (ДНК-технология, Россия) согласно инструкции производителя. Присутствие генетического материала T.pallidum в образцах клинического материала подтверждалось методом ПЦР с праймерами к видоспецифичному гену polA, кодирующему ДНК-полимеразу I данного микроорганизма [20]. Молекулярное типирование образцов с подтвержденным наличием генетического материала T.pallidum проводили в соответствии с алгоритмом, рекомендованным Центром контроля и профилактики заболеваний США (Center for Disease Control and Prevention, Druid Hills, Atlanta, Georgia). Алгоритм проведения и порядок оценки результатов метода описаны ранее [21]. Амплификацию генов T.pallidum осуществляли на основе пар праймеров [20] с использованием ДНК-амплификатора Т100 Thermal Cycler (Bio-Rad, США). С целью поиска генетических детерминант резистентности к макролидам проводили анализ фрагмента гена 23S рРНК [7]. Первичная расшифровка нуклеотидных последовательностей проведена в программе Sequencing Analysis 5.3.1. Для выравнивания анализируемых фрагментов целевых генов на референсные сиквенсы T.pallidum использовали программу Mega 5.

Результаты

В 49 клинических образцах методом ПЦР с праймерами к гену polA было подтверждено присутствие ДНК T.pallidum. Молекулярное типирование изолятов по генам arp, tpr и tp0548 позволило идентифицировать полный молекулярный субтип каждого изолята. Были выявлены по одному варианту генов arp (вариант 14) и tpr II (вариант d) и 3 варианта гена tp0548 (варианты d, f, g). Таким образом, в проанализированной популяции определены три молекулярных субтипа: 14 d/f (32 штамма, 65%), 14 d/d (10 штаммов, 20%) и 14 d/g (7 штаммов, 15%) из которых 14 d/d обнаружен впервые (Рисунок 1).

Тип гена tp0548

Нуклеотидная последовательность

Рисунок 1. Варианты нуклеотидных последовательностей в гене tp0548 T.pallidum.

Figure 1. Nucleotide sequence variants in the tp0548 gene of T.pallidum.

Транзиция A2058G с доказанной ролью в обеспечении высокого уровня резистентности к макролидным антибиотикам оказалась ассоциирована с субтипами 14 d/d и 14 d/g (всего 17 штаммов, 35%). Распределение изолятов по федеральным округам представлено в таблице 1.

Таблица 1. Распределение субтипов T.pallidum по федеральным округам

Table 1. Distribution of T.pallidum subtypes by federal districts

Федеральный округ	Субъект РФ	Количество изолятов по субтипам
Федеральный округ	Субъект РФ	14d/f	14 d/g*	14 d/d*
Северо-Кавказский	г.Ставрополь	-	-	2
Сибирский	г. Кызыл	24	-	-
Центральный	г.Москва	8	6	8
Центральный	Калужская область	-	1	-

*Субтипы, содержащие мутацию устойчивости к макролидам

*Subtypes containing a macrolide resistance mutation

Обсуждение

В 2022 г на территории представленных федеральных округов идентифицированы 3 субтипа T.pallidum. Можно отметить продолжающееся доминирование эндемичного для Российской Федерации субтипа 14d/f, сохраняющего чувствительность к макролидам. Устойчивый к макролидам субтип 14 d/g ранее уже обнаруживался в Сибирском и Центральном ФО [7, 17]. В 2022 г. в Центральном (преимущественно) и Северо-Кавказском федеральных округах появился новый для Российской Федерации устойчивый к макролидам субтип 14 d/d. Данный субтип T.pallidum никогда не был преобладающим ни в одной стране, однако является одним из наиболее распространённых в Буэнос-Айресе, Аргентина [22]; редко встречается в Чешской Республике [22], спорадически обнаруживается в Париже, Франция [23] и в Австралии [24]. В Сан-Паулу, Бразилия выделены изоляты T. pallidum данного субтипа с мутацией устойчивости к макролидам A2058G [25].

Данные исследования свидетельствуют о постоянном расширении популяции T. pallidum на территории Российской Федерации, в том числе за счёт появления азитромицин-устойчивых штаммов. По данным Федеральной службы государственной статистики в 2022 г. в Москве выявлено в 2 раза больше больных с впервые в жизни установленным диагнозом сифилиса, чем годом ранее [1]. Одной из причин роста заболеваемости является увеличение миграционных потоков. Менее очевидными причинами могут быть бесконтрольное использование антибиотиков, маскирующее симптомы заболевания, а также рост обращаемости за медицинской помощью после периода пандемии.

Заключение

Непрерывный мониторинг циркулирующих на территории Российской Федерации штаммов T. pallidum может облегчить понимание географического распространения инфекции и антибиотикорезистентности штаммов.