Results of a study of genetic factors predisposing to the development of psoriasis among the population of the Russian Federation

Full Text

Работа выполнена в рамках государственного задания Министерства здравоохранения Российской Федерации ФГБУ «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии» на период 2012-2014 гг. Раздел I. Выполнение фундаментальных научных исследований. Наименование темы: «Изучение генетических факторов предрасположенности к развитию псориаза» по Государственному контракту 114/БУ-2012-051 от 16.01.2012 г.) Ш псориаз - воспалительное иммуноассоциирован-ное заболевание мультифакториальной природы с доминирующей ролью генетических факторов [1-3]. показатели заболеваемости населения псориазом в разных регионах мира варьируют от 0,6 до 5%, составляя в среднем 3% [4, 5]. В Российской Федерации заболеваемость псориазом, по данным официального государственного статистического учета, в 2010-2011 годах составила около 1% [4]. Эпидемиологические исследования, проведенные в XX веке, в ходе которых это заболевание изучалось в нескольких поколениях родственников, создали основу формирования генетической теории псориаза. В результате последующих работ было установлено значение генов, кодирующих белки главного комплекса гистосовместимости классов I и II, в развитии псориаза [6]. Широкомасштабные мультицентровые исследования, осуществляющиеся с начала XXI века по программе полногеномного анализа ассоциаций GWAS (Genome-wide association studies), направленные на выявление ассоциаций между генотипом и фенотипом человека, определили спектр различных генетических маркеров предрасположенности к псориазу; результаты этой работы представлены в базе данных Национального института здоровья США, доступной для исследователей в сети Интернет [7], и широко используются в качестве основы для молекулярногенетических исследований в различных регионах мира. В результате проведенных исследований была установлена роль в развитии псориаза одиночных нуклеотидных полиморфизмов (SNP), локализованных как в структуре генов главного комплекса гистосовместимости, так и в других регионах генома человека [8]. при этом изменение одного нуклеотида в молекуле ДНК оценивается как значимое, регистрируется в информационных базах данных и включается в эпидемиологические исследования, если частота его встречаемости в популяции превышает 1% [9]. К началу 2001 года в геноме человека было обнаружено более 1,5 миллиона SNP, информация о них также помещена в общедоступные базы данных [10], что создало возможность изучения генетической основы ряда мультифакториальных заболеваний в популяциях. Геномные исследования, осуществляемые по программе GWAS, проводятся с использованием специально разработанных биологических микрочипов высокой плотности (например, микрочипов формата Illumina Hap310K и Illumina Hap550K) [12], представляющих собой твердофазную подложку, на которой иммобилизованы изучаемые последовательности ДНК [15]. Высокая стоимость этого метода исследования и отсутствие репрезентативных ДНК-банков, основанных на получении, выделении и хранении образцов ДНК, полученных от больных мультифакториаль-ными заболеваниями, задерживает внедрение данной технологии в России. В связи с этим представляется рациональным изучение уже известных маркеров заболевания, в частности, выявленных методом GWAS, у больных псориазом в российской популяции. Следует отметить, что до настоящего времени в Российской Федерации крупных исследований по изучению частоты выявления представленных в международных базах данных генетических маркеров, ассоциированных с развитием псориаза, не проводилось; в научных публикациях имеются сообщения об идентификации лишь отдельных маркеров [11, 13-14]. В связи с вышеизложенным для выполнения настоящего исследования на основании анализа данных информационной базы GWAS нами были отобраны [27] гены, отвечающие за нарушение барьерной функции кожи, участвующие в реализации врожденного и адаптивного иммунитета, а также в презентации антигена (IL-28RA, IL-23R, TNFAIP3, SERPINB8, ZNF816A, TNIP1, TRAF3IP2, ZNF313, ERAP1, REL, IL-12B, NFKBI и TYK2), включающие одиночные нуклеотидные полиморфизмы, описанные в зарубежной литературе как маркеры заболевания. Роль этих полиморфизмов в развитии псориаза в российской популяции не изучена. Необходимым условием для выполнения проводимого крупномасштабного исследования по изучению распределения частот аллелей и генотипов маркеров локусов генов предрасположенности к развитию псориаза в российской популяции (планируемая популяционная выборка - не менее 500 больных псориазом и не менее 150 здоровых лиц) является определение методов, которые позволяют оптимально идентифицировать SNP. В связи с вышеизложенным целью настоящего исследования явилась оценка частоты встречаемости в российской популяции генов предрасположенности к псориазу выбранными методами молекулярногенетических исследований. Обоснование методологии изучения генетических факторов предрасположенности к развитию псориаза в российской популяции при выборе методологии определения SNP-маркеров были изучены известные современные методы определения SNP. Следует отметить, что ни один 80 к № 5, 2013 современный метод генотипирования не является универсальным, однако некоторые методы генотипирования доступны для осуществления многих исследовательских проектов [15]. Представленные ниже методы применяются в случаях, когда известны первичная последовательность анализируемого фрагмента ДНК, тип и локализация выявляемой однонуклеотидной замены. Обнаружить специфическую последовательность можно с помощью следующих основных методов ти-пирования SNP: 1) аллель-специфическая гибридизация (полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени); 2) аллель-специфический рестрикционный анализ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов, ПДРФ-анализ); 3) аллель-специфическая достройка или удлинение праймера; 4) аллель-специфическое лигирование олигону-клеотидных фрагментов. Методы генотипирования включают стадии дискриминации аллелей1 генов и стадии детекции продуктов дискриминации. Во всех этих методах выявление маркеров обеспечивается за счет ферментов, обладающих способностью различать комплементарную и некомлементарную пару нуклеотидных оснований (мисматч) [16-19]. Все четыре метода надежны и применяются для решения различных задач. 1. Аллель-специфическая гибридизация (полимеразная цепная реакция в реальном времени, real-time PCR). Простейшим механизмом для генотипирования является аллель-специфическая гибридизация, основанная на разделении двух ДНК-мишеней (аллелей) в одном локусе гомологичных хромосом, несущих аллели изучаемого гена. Для ее проведения конструируются два аллель-специфических зонда с полиморфным основанием в центре нуклеотидной последовательности зонда. Стабильные гибридизованные зонды образуются при условии полной комплементарности оснований зонда и изучаемого образца. При несоответствии даже одной пары оснований гибридизация зонда является нестабильной (рис. 1) [28]. Основной задачей для обеспечения получения надежного результата при анализе аллельных дискриминаций является подбор оптимальных зондов. Этот механизм генотипирования реализуется в формате ПЦР в реальном времени. Реакционная смесь содержит пару праймеров для амплификации фрагмента исследуемого гена и два аллель-специфических зонда, меченных разными флуорофорами. В ходе ПЦР 5’-экзонуклеазная активность Taq-полимеразы разрушает зонд, что приводит к высвобождению флуо-рохрома и накоплению сигнала. Taq-полимераза разрушает зонды с высоким сродством к ПЦР-продукту. Таким образом, накопление сигнала происходит пропорционально эффективности гибридизации. Идентификация аллельных вариантов гена основана на различии эффективности гибридизации зонда в каждом цикле ПЦР с комплементарным зонду аллелем и некомплементарным аллелем (с заменой одного нуклеотида). Несмотря на то что различия эффективности G A Неспаривание Гибридизация Рис. 1. Аллель-специфическая гибридизация Гибридизация не происходит C A 1 Аллели - различные формы одного и того же гена, расположенные в одинаковых участках (локусах) гомологичных хромосом и определяющие альтернативные варианты развития одного и того же признака. Вестник дерматологии и венерологии Научные исследования л 81 гибридизации зондов незначительны, от цикла к циклу происходит накопление разницы в сигналах, полученных от двух зондов, что позволяет достоверно различать аллели и идентифицировать генотип в изучаемом SNP [20-21]. 2. Аллель-специфический рестрикционный анализ (анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ, RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism). ПДРФ-анализ основан на выявлении сайтов рестрикции2 геномной ДНК. Мутационная изменчивость ДНК в сайтах рестрикции может быть легко обнаружена по изменению длины рестрикционных фрагментов ДНК, гибридизующихся со специфическими ДНК-зондами. При наличии мутации в одном из сайтов рестрикции этот сайт остается нерасщепленным по сле завершения рестрикции, что приводит к слиянию соседних рестрикционных фрагментов ДНК, разделяемых мутантным сайтом, и образованию фрагмента ДНК большего размера. ПДРф-анализ включает этапы: выделение геномной ДНК, ее рестрикцию специфической эндонуклеазой, элекрофоретическое разделение образующихся фрагментов ДНК и идентификацию фрагментов ДНК, содержащих полиморфный сайт рестрикции, путем блот-гибридизации по Саузер-ну. Метод ПДРф широко используется в генетических исследованиях популяций, поскольку наличие в геноме исследуемого организма рестрикционного фрагмента ДНК определенной длины является прекрасным генетическим маркером и одновременно фенотипическим признаком, тесно связанным с генотипом организма (рис. 2) [25, 26]. Нормальная ДНК Мутантная ДНК EcoRI EcoRI 1 Т 5' GAATTC 3' 5' GAGTTC 3' 3' CTTAAG 5' 3' CTCAAG 5' EcoRI * EcoRI 1 Обработка 1 Обработка ▼ рестриктазой т рестриктазой 5' G + AATTC 3' 5' GAGTTC 3' 3' CTTAA G 5' 3' CTCAAG 5' 1 Электрофорез ДНК е л е СО К Н Д - - - я и а р S - 1 f EcoRI: - + - + J К J Норма Мутация | Рис. 2. Аллель-специфический рестрикционный анализ [24] 2 Сайт рестрикции - строго определенная последовательность нуклеотидов ДНК, узнаваемая и расщепляемая ферментами - рестрикта-зами. 82 к № 5, 2013 3. Аллель-специфическая достройка праймера, или удлинение праймера. Надежным механизмом аллельной дискриминации является удлинение праймера. Метод основан на способности ДНК-полимеразы включать в синтезируемую цепь дезоксирибонуклеотидтрифосфа-ты, комплементарные ДНК-матрице. Способы удлинения праймеров включают две основные группы. К первой относят процессы удлинения праймеров с помощью отдельных нуклеотидов (минисеквениро-вание), где полиморфное основание определяется за счет включения ДНК-полимеразой дидезоксину-клеотидтрифосфата, комплементарного полиморфному основанию матрицы. Способы, основанные на аллель-специфичном удлинении, при котором ДНК-полимераза работает лишь в случае полного соответствия праймера последовательности цепи, относят ко второй группе. В этом случае одновременно проводят две реакции ПЦР, в каждой из которых одним из праймеров служит аллель-специфическая мутантная олигонуклеотидная последовательность или олигонуклеотидная последовательность дикого типа соответственно. Данные олигонуклеотидные последовательности несут на 3’-конце соответствующие нуклеотиды (мутантный или дикого типа). В качестве второго праймера выступает одна и та же олигону-клеотидная последовательность, так чтобы в обеих реакциях ПЦР аплифицировались участки ДНК одинаковой длины. При определенных условиях и составе реакционной смеси наличие негомологичного спаривания на 3’-конце праймера препятствует синтезу ДНК (рис. 3). Таким образом, при наличии SNP-маркера в исследуемой матричной ДНК амплифицированные ПЦР-продукты образуются только в том случае, если в качестве аллель-специфического праймера выбирается мутантная олигонуклеотидная последовательность, тогда как с олигонуклеотидного праймера дикого типа ПЦР-реакция блокируется. Мониторинг произошедшего удлинения праймера позволяет сделать вывод о наличии искомого(ых) аллеля(ей) в образце ДНК. Данный механизм дискриминации аллелей реализуется методом ПЦР с последующей детекцией продуктов реакции с помощью электрофоретического разделения в агарозном геле либо с помощью капиллярного электрофореза (SNaPshot метод) [22], масс-спектрометрией, ДНК-микрочипами [23] и т. д. Однако метод является трудоемким, дорогостоящим и требует значительных затрат времени для оптимизации условий проведения реакций ПЦР [28]. Праймер 1 I Праймер 2 I Праймер 2 [ Праймер 1 I Нормальная ДНК А ■ А - ]т: С Общий праймер Амплификация Амплификация не идет Т Мутантная ДНК С Общий праймер Амплификация Амплификация не идет G Рис. 3. Аллель-специфическая достройка праймера [24] Вестник дерматологии и венерологии Научные исследования л 83 4. Аллель-специфическое лигирование олиго-нуклеотидных фрагментов. ДНК-лигаза является высокоспецифичным ферментом, который устраняет одноцепочечные разрывы в ДНК. Метод лигирования одноцепочечных разрывов основан на способности фермента ДНК-лигазы ковалентно сшивать расположенные друг за другом нуклеотиды. В процессе реализации метода используются три зонда, которые обеспечивают точное соединение двух прилегающих последовательностей целевой ДНК. Один зонд (основной) располагается с 5’-стороны от SNP. Два других зонда - ал-лель-специфические, меченые различными красителями, отличаются 3’-нуклеотидом, соответствующим позиции SNP [28]. Процесс исследования включает несколько циклов гибридизации, лигирования и денатурации. В ходе лигирования происходит сшивание основного и аллельного зондов. Полученные продукты лигирования детектируют в режиме реального времени или проводят электрофоретический анализ меченых однонитевых фрагментов ДНК [18]. Этот метод также является трудоемким, дорогостоящим и требует значительных затрат времени для подбора расходных материалов. На основании анализа преимуществ и недостатков приведенных молекулярных технологий в качестве метода исследования генетических факторов предрасположенности к развитию псориаза нами был выбран метод аллель-специфической гибридизации в формате ПЦР в реальном времени. Метод обеспечивает осуществление идентификации SNP, отличается высокой специфичностью, по сравнению с другими методами позволяет значительно ускорить процедуру анализа полиморфизмов на большой выборке обследуемых. Материалы и методы Материалы исследования Материалом для проведения экспериментальных исследований явились образцы цельной крови, полученные от больных псориазом (n = 45) и здоровых добровольцев (n = 45). Взятие образцов проводилось в вакуумные системы для забора крови типа Vacuette (BD Vacutainer, Великобритания) объемом 4 мл (пробирки с дозированным отрицательным давлением), в которых содержалась этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) - стабилизатор свертывания крови, не ингибирующий ПЦР. До исследования образцы крови хранились в замороженном состоянии в морозильной камере, обеспечивающей постоянное поддержание температуры на уровне -20 оС. Перед началом исследования обеспечивали оттаивание образцов при комнатной температуре в течение 30 минут. Методология проведения исследования При разработке методологии проведения исследования для выявления частоты встречаемости SNP у больных псориазом и здоровых лиц был выбран метод аллель-специфической гибридизации в формате ПЦР в реальном времени. Исследование проводилось в несколько этапов: ■ выделение из образца геномной ДНК и оценка ее качества; ■ амплификация фрагментов генов и аллель-специ-фическая гибридизация мишеней и зондов в формате ПЦР в реальном времени. Выделение ДНК из образцов крови проводилось с использованием набора реагентов Diatom™ DNA Prep 100 (Biokom, Россия) в соответствии с инструкциями производителя. В состав указанного набора входит лизирующий реагент с гуанидинтиоционатом. Из рабочего раствора ДНК сорбировали на сорбенте С A- Р Р 84 к № 5, 2013 NucleoSTM, затем отмывали от белков и солей спиртовым раствором и элюировали буфером. Качество ДНК в пробах оценивалось с помощью электрофоретического разделения ДНК в 1% агарозном геле с последующим фотографированием гелей в ультрафиолетовом свете с длиной волны 310 нм с помощью встроенной в трансиллюминатор фотокамерой (Biorad, Германия). Очищенный раствор ДНК объемом 100 мкл помещался в микропробирки типа Eppendorf (Eppendorf, Германия) объемом 1,5 мл и хранился в условиях низкой температуры (-20 °С). Перед началом исследования с использованием программы Oligo6 производился подбор праймеров для амплификации фрагментов генов, включающих изучаемые полиморфизмы, а также подбор специфичных зондов, позволяющих идентифицировать соответствующие генотипы аллели в месте нахождения исследуемых SNP. Температура отжига праймеров и зондов в реакции подбиралась по формуле: 2*(А+Т) + 4*(G+C), где А и Т - количество адениновых и тимидиновых остатков в олигонуклеотиде, а G и С -количество гуаниновых и цитозиновых остатков. Перечень праймеров и зондов представлен в табл. 1. Амплификация каждого из фрагментов генов проводилась с использованием набора с HS Taq ДНК-полимеразой (Евроген) в соответствии с инструкцией Таблица 1 Праймеры и зонды для осуществления амплификации фрагментов генов и аллель-специфической гибридизации мишеней (SNP) и зондов в формате ПЦР в реальном времени Ген Однонуклеотидные полиморфизмы Праймеры (для амплификации фрагмента гена) Зонды (для идентификации полиморфизма гена) IL4/IL13 rs20541 20541for GTT CTACT CATGTGCTGA 20541rev ATCTGCAACTT CAATAGT C 20541A FAM-CGCGAGGGACAGTTCAAC-BHQ1 20541G Cy5-CGCGAGGGACGGTTCAAC-BHQ2 IL-28RA rs4649203 4649203for GCCTCTCTGGGTAGAAT 4649203rev CCAGGATGTTGAAGAGG 4649203G FAM-GCTGGGTTGCAGAGGAGG-BHQ1 4649203A Cy5-GCTGGATTGCAGAGGAGG-BHQ2 NFKBI rs8016947 8016947for TGAGAAAT CCTGCCACAT 8016947rev TGAGAGTTGGCTTCCTAA 8016947T FAM-GCAAACTTGTATTCTCCAGC-BHQ1 8016947G Cy5-GCAAACTTGTATTCTCCAGC-BHQ2 IL-23R rs11209026 11209026for CAACAGAGGAGACATTGGA 11209026rev GGCATGGGTAAGTACTTATT 11209026G FAM-GATCATTCCGAACTGGGTAG-BHQ1 11209026A Cy5-GATCATTCCGAACTGGGTAG-BHQ2 TNFAIP3 rs610604 610604for GGATGGACCAAGATTGATTA 610604rev CAT CATTAGCT CATAGAACAA 610604G FAM-GAAAAGTGTGAGCTCTTCATC-BHQ1 610604T Cy5-GAAAAGTGTTAGCT CTT CAT C-BHQ2 SERPINB8 rs514315 514315for ACATAGAAGTAGAATGGCT 514315rev GCTGAACATAATTAGGCAT 514315T Cy5-GGTTTTT CT CT CTT CT CACC-BHQ2 514315C FAM-GGII 1 1 1CTCCCTTCTCACC-BHQ1 ZNF816A rs9304742 9304742for CCAAAGTGCTAGGATTACA 9304742rev TATCTGGAGAGTTGGACAT 9304742 FAM-CCAACCAATGTGTTCGTAACA-BHQ1 9304742 Cy5-CCAACCAATGCGTTCGTAACA-BHQ2 HLA-C rs10484554 10484554for GACTTAACAT CAAGGTT CT 10484554rev GGTTGAGTTAAACT CTGTT 10484554 FAM-TCCTATCTCACCTATGACGTC -BHQ1 10484554 Cy5-T CCTAT CT CACTTATGACGTC-BHQ2 MIF rs755622 755622for TGACTTAGTGAAAGGACTA 755622rev AGTGGGGAAGTCACCGC 755622 FAM-GAGAACAGGTTGGAGCGGT-BHQ1 755622 Cy5-GAGAACAGCTTGGAGCGGT-BHQ2 TNIP1 rs17728338 17728338for T CATTAAGTGTAAACTGCAT 17728338rev CTATGCTCTGAGGACAAAT 17728338 FAM-TTAGTAGGACCGTTGCAAAAG-BHQ1 17728338 Cy5-TTAGTAGGACCATTGCAAAAG-BHQ2 TYK2 rs12720356 12720356for TTT CAACCCAGACCAAACT 12720356rev CACCATCTTCCAAGCCAT 12720356 FAM-TTACAGATATCATGGTGACAGA-BHQ1 12720356 Cy5-TTACAGATAGCATGGTGACAGA-BHQ2 TRAF3IP2 rs13190932 13190932for GAGGAATCAGAACCACC 13190932rev T CCAGAACTTGAGTGCG 13190932C FAM-AATCACCAGCGGCCTGTAT-BHQ1 13190932T Cy5-AAT CACCAGTGGCCTGTAT-BHQ2 IL-23A rs2066808 2066808for CTAGTT CCAGCT CTAATGA 2066808rev TCAGAAAAGTTAGGCCACT 2066808 FAM-CAAATGAAATCAGGAATGGTAGA-BHQ1 2066808 Cy5-CAAATGAAATCAGGAATGGTAGA-BHQ2 ZNF313 rs2235617 2235617for AACATTTGTAAAAAGGCTAG 2235617rev TATAAAAAT CCAATGCCCCA 2235617 FAM-GACTGCTTTCTCCTGTGCCT-BHQ1 2235617 Cy5-GACTGCTTTGTCCTGTGCCT-BHQ2 IL-28RA rs4649203 4649203for GCCTCTCTGGGTAGAAT 4649203rev CCAGGATGTTGAAGAGG 4649203G FAM-GCTGGGTTGCAGAGGAGG-BHQ1 4649203A Cy5-GCTGGATTGCAGAGGAGG-BHQ2 ERAP1 rs27524 27524 for CCTAGCATATGCATATATAA 27524rev GATGATAATGGACAGGTAAA 27524 FAM-CCTTTACAATAGCATAAAACATAC-BHQ1 27524 Cy5-CCTTTACAGTAGCATAAAACATAC-BHQ2 REL rs702873 702873for ATTAGGAAGATTAGTGGTGT 702873rev CTAAATAAGTCAAGGACCTA 702873FAM-TAGATGATGCGTACGTCTACC-BHQ1 702873 Cy5- TAGATGATGTGTACGT CTACC-BHQ2 IL-12B rs3213094 3213094rev AAGGCAGATACTGTTATTAT 3213094for AG CACAATTT CAGTTTCATA 3213094 FAM-CGAGAACAACGAACCAAGAC-BHQ1 3213094 Cy5-CGAGAACAATGAACCAAGAC-BHQ2 Вестник дерматологии и венерологии Научные исследования л 85 производителя с добавлением праймеров по 20 пмоль каждого, зондов по 10 пмоль и 200 нг ДНК человека, в формате 96-луночного планшета. пЦР фрагментов всех генов проводилась в режиме реального времени при разных условиях (табл. 2). при амплификации гена ERAP1 температура отжига составляла 54 °С, генов IL-23A, SERPINB8, TRAF3IP2 и IL-23R - 56 °С, генов TNFAIP3 и TNIP1 - 58 °С, гена REL - 60 °С и генов IL-28RA, zNF816A и zNF312 - 62 °С. Считывание сигнала флуоресценции с каналов детекции FAM и cy5 производили на стадии отжига праймеров (54 °С-62 °С); при этом программное обеспечение прибора представляло первичные данные в виде диаграммы распределения аллелей. О наличии в пробе одного или другого аллеля судили по отношению уровней флуоресценции от обоих зондов. программное обеспечение представляло результаты генотипирования в виде распределения аллелей. Аллели, меченные флуорофором cy5, обозначались зеленым цветом, аллели, меченные флуорофором FAM, - синим цветом, красным цветом обозначалась комбинация двух аллелей. На рисунке 5 представлено распределение аллелей гена TNFAIP3 (полиморфизм rs610604) у больных псориазом и здоровых добровольцев. Два SNP (полиморфизм rs8016947 в гене NFKBI и полиморфизм rs12720356 в гене TYK2) методом ал-лель-специфической гибридизации идентифицировать не удалось. Данное обстоятельство могло быть обусловлено сложной структурой нуклеотидной последовательности ДНК, окружающей данные SNP-маркеры, в связи с чем подобранные зонды работали неэффективно. поэтому для изучения полиморфизма rs8016947 в гене NFKBI и полиморфизма rs12720356 в гене TYK2 был применен метод анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (пДРф-анализ). Данные полиморфизмы входили в сайты рестрикции эндонуклеаз: Hinf1 (Сибэнзим, Россия) для исследования полиморфизма rs8016947 в гене NFKBI и EcoRV (Сибэнзим, Россия) для исследования полиморфизма rs12720356 в гене TYK2. протокол пДРф-анализа включал описанные выше этапы выделения ДНК из биообразцов крови, полученных от больных псориазом и здоровых добровольцев, и проведение методом пЦР амплификации фрагментов генов NFKBI и TYK2 с использованием ранее подобранных праймеров и условий проведения реакции. Дальнейшее исследование проводилось следующим образом. электрофоретическое разделение продуктов пЦР-реакции осуществлялось в 2% агарозном геле. Для приготовления 100 мл 2% агарозного геля 1 г агарозы смешивали с 10 мл 10 * TBE и 90 мл dH2O. приготовленную смесь прогревали в СВч-печи 5-7 мин. (до полного растворения агарозы), затем в нее добавляли 10 мкл бромистого этидия (1% раствор) и перемешивали. Расплавленную агарозу охлаждали до температуры 50-60 °С и заливали в планшет для заливки геля. Для получения в агарозном геле карманов для нанесения образцов на планшет устанавлиtiD laa we ни лш 4» шт чда *т дов зёвя кш Рис. 5. Диаграмма распределения аллелей гена TNFAIP3 (полиморфизм rs610604) у больных псориазом и здоровых добровольцев. "омозиготы А/А обозначены треугольниками зеленого цвета, гомозиготы С/С -треугольниками синего цвета, гетерозиготы А/С - треугольниками красного цвета | Таблица 2 Условия амплификации генов при проведении реакции амплификации Рекомендованные условия амплификации Количество циклов амплификации 95 °С - 7 мин. 1 цикл 95 °С - 10 сек. 40 циклов 54-62 °С - 1 мин. 72 °С - 1 сек. 86 к № 5, 2013 вали гребенки. Раствор агарозы застывал в течение 15-30 мин. при комнатной температуре. Результаты прохождения реакций амплификации оценивали с помощью трансиллюминатора с фотокамерой для фотографирования гелей в ультрафиолетовом свете с длиной волны 310 нм (Biorad, Германия). Дополнительно для проведения рестрикции продуктов амплификации ДНК использовались рестрик-тазы: ■ рестриктаза Hinf1 (Сибэнзим, Россия) для исследования полиморфизма rs8016947 в гене NFKBI; ■ рестриктаза EcoRV (Сибэнзим, Россия) для исследования полиморфизма rs12720356 в гене TYK2. Для проведения рестрикции готовили рестрикционную смесь, состав компонентов которой в расчете на одну пробирку приведен в табл. 3. После приготовления смесь компонентов аккуратно перемешивали и центрифугировали на аппарате Vortex (Биосан, Латвия). Затем в каждую микропробирку объемом 0,2 мл вносили 6 мкл приготовленной реакционной смеси для проведения рестрикции и 14 мкл продукта амплификации ДНК соответству ющего фрагмента. Общий объем реакционной смеси составлял 20 мкл. Рестрикция продуктов амплификации генов NFKBI и TYK2 проводилась в амплификаторе Dyad (Biorad, Германия). На первой стадии продукты амплификации подвергались обработке при температуре 37 °С в течение 120 мин. для осуществления рестрикции, а затем - обработке при 80 °С в течение 5 мин. для инактивации фермента. Результаты ПДРФ определялись визуально при анализе агарозного геля (рис. 6, 7) путем определения количества полученных фрагментов ДНК. При анализе полиморфизма rs12720356 в гене TYK2 полное расщепление ПЦР продукта указывало на гомозиготный генотип Т/Т данного гена; появление трех продуктов рестрикции указывало на гетерозиготный Т/G генотип данного гена. При анализе полиморфизма rs8016947 в гене NFKBI полное расщепление продукта ПЦР указывало генотип G/G; появление трех продуктов рестрикции указывало на гетерозиготный Т/G генотип данного гена, а появление одного продукта позволяло идентифицировать генотип Т/Т. Таблица 3 Состав реакционной смеси для проведения рестрикции продуктов амплификации генов NFKBI и TYK2 № Наименование реагента Объем, мкл 1 10 x буфер для рестриктазы 2 Рестриктаза dH2O Рис. 6. Результаты ПДРФ-анализа фрагмента гена TYK2. Дорожка 4 - маркер молекулярных весов 100 b.p (100-1000); дорожки 1, 2 и 3 - результаты рестрикции ДНК фрагмента гена TYK2 [дорожки 1 и 2 - генотип rs12720356 Т/Т (дикий тип), дорожка 3 -генотип rs12720356 Т/G Результаты ПДРФ-анализа фрагмента гена NFKBI. Дорожка 13 - маркер молекулярных весов 100 b.p (100-1000); дорожки 1-12 -Рис. 7. результаты рестрикции ДНК фрагмента гена NFKBI [дорожки 4 и 5 - генотип rs8016947 Т/Т (дикий тип), дорожки 2, 7, 9, 11 и 12 -генотип rs8016947 Т/G, дорожки 1, 3, 6, 8, и 10 - генотип rs8016947 G/G 3 Вестник дерматологии и венерологии Научные исследования л 87 Результаты исследования Результаты идентификации 11 полиморфизмов методом аллель-специфической гибридизации в формате ПЦР в реальном времени Методом аллель-специфической гибридизации в формате ПЦР в реальном времени на биоматериалах, полученных от 45 больных псориазом и 45 здоровых добровольцев, были установлены генотипы 11 из 13 изучавшихся маркеров предрасположенности к псориазу; установлена частота их встречаемости у больных псориазом и здоровых (табл. 4). Так, при изучении полиморфизма rs11209026 в гене IL-23R у подавляющего большинства обследованных был обнаружен генотип G/G: у 44 больных псориазом (80%) и у 41 здорового добровольца (74,5%). У 1 больного псориазом (2,2%) и у 2 здоровых (4,4%) был обнаружен генотип A/G. Генотип A/A у больных псориазом не был выявлен, но был обнаружен у 2 здоровых лиц (4,4%). В результате изучения методом аллель-специфи-ческой гибридизации полиморфизма rs4649203 гена IL-28RA у больных псориазом были обнаружены следующие генотипы: генотип AA - у 24 пациентов (53,3%), генотип GG - у 6 человек (13,3%) и генотип AG - у 15 (33,3%). У здоровых лиц данные генотипы встречались с частотой соответственно 57,8% (26/45), 8,9% (4/45) и 33,3% (15/45). Таблица 4 Частота встречаемости различных генотипов SNP генов IL-23R, IL-28RA, NFKBI, SERPINB8, TRAF3IP2, TNFAIP3, REL , ZNF313, IL-12B, TYK2, TNIP1, ZNF816A , ERAP1 у больных псориазом (n = 45) и здоровых добровольцев (n-45) Ген/ генотип Группы IL-23R (rs11209026) IL-28RA (rs4649203) NFKBI (rs8016947) AA GG AG AA GG AG GG TT GT Больные псориазом 0/45 0 44/45 80% 1/45 2,2% 24/45 53,3% 6/45 13,3% 15/45 33,3% 14/45 31,1% 5/45 11,1% 26/45 57,8% Контрольная группа 2/45 4,4% 41/45 74,5% 2/45 4,4% 26/45 57,8% 4/45 8,9% 15/45 33,3% 13/45 28,9% 8/45 17,8% 24/45 46,2% SERPINB8 (rs514315) TRAF3IP2 (rs13190932) TNFAIP3 (rs610604) СС TT CT AA GG AG АА СС АС Больные псориазом 7/45 15,6% 25/45 55,6% 13/45 28,9% 0/45 0 31/45 68,9% 14/45 31,1% 23/45 51,1% 4/45 8,9% 18/45 40,0% Контрольная группа 4/45 8,9% 22/45 48,9% 19/45 42,2% 0 0 33/45 73,3% 12/45 26,7% 26/45 57,8% 3/45 6,7% 16/45 35,6% REL (rs702873) ZNF313 (rs2235617) IL-12B (rs3213094) AA GG AG CG CC GG AA GG AG Больные псориазом 4/45 8,9% 22/45 48,9% 19/45 42,2% 18/45 40,0% 16/45 35,6% 11/45 24,4% 4/45 8,9% 26/45 57,8% 15/45 33,3% Контрольная группа 9/45 20,0% 16/45 35,6% 21/45 46,7% 20/45 44,4% 14/45 31,1% 11/45 24,4% 2/45 4,4% 25/45 55,6% 18/45 40,0% TYK2 (rs1272035) TNIP1 (rs17728338) ZNF816A (rs9304742) TT TG - GG AG AA CC CT TT Больные псориазом *43/45 95,6% *2/45 4,4% - 32/45 71,1% 13/45 28,9% 0/45 0 4/45 8,9% 17/45 37,8% 24/45 53,3% Контрольная группа 35/45 77,8% 10/45 22,2% - 40/45 88,9% 15/45 33,3% 0 6/45 13,3% 19/45 42,2% 20/45 44,4% ERAP1 (rs27524) GG AG AA Больные псориазом 18/45 40,0% 25/45 55,6% 2/45 4,4% Контрольная группа 19/45 42,2% 21/45 46,7% 5/45 11,1% Примечание: * Отличия между больными пориазом и здоровыми достоверны. 88 к № 5, 2013 Полиморфизм rs514315 гена SERPINB8 характеризовался следующими вариантами: наиболее часто встречался генотип Т/Т (у 25 больных псориазом (55,6%) и у 22 здоровых (48,9%)); гетерозиготный генотип С/Т был зарегистрирован у 13 больных псориазом (28,9%) и 19 здоровых добровольцев (42,2%); гомозиготный генотип С/С был отмечен у 7 больных псориазом (15,6%) и 4 здоровых (8,9%). При изучении полиморфизма rs13190932 гена TRAF3IP2 были выявлены генотипы A/G и G/G. Наиболее часто встречался генотип G/G: его частота у больных псориазом составила 68,9% (у 31 из 45 человек), у здоровых - 73,3% (у 33 из 45 человек). Вторым по частоте выявления был гетерозиготный генотип A/G: частота данного генотипа у больных псориазом составила 31,1% (у 14 из 45 человек), у здоровых соответственно 26,7% (у 12 из 45 человек). Полиморфизм rs610604 гена TNFAIP3 характеризовался следующими вариантами: А/А, С/С и А/С. Наиболее часто регистрировался генотип А/А: его частота у больных псориазом составила 51,1% (у 23 из 45 человек), у здоровых 57,8% (у 26 из 45 человек). Вторым по частоте встречаемости был генотип А/С, который регистрировался у 18 из 45 больных псориазом (40,0%) и у 16 из 45 здоровых (35,6%). При изучении полиморфизма rs702873 гена REL в выборке обследованных были выявлены генотипы A/A,G/G и A/G. При этом с близкой частотой, как у больных псориазом, так и у здоровых, встречались генотипы G/G и A/G: генотип G/G был зарегистрирован у 22 больных псориазом (48,9%) и у 16 здоровых лиц (35,6%); генотип A/G встречался у 19 больных псориазом (42,2%) и у 21 здорового добровольца (46,7%). Наиболее редким в выборке был генотип A/A, который был установлен у 4 больных псориазом (8,9%) и у 9 здоровых лиц (20,0%). При изучении полиморфизма rs2235617 в гене ZNF313 было установлено 3 варианта генотипов: C/C, G/G и C/G. При этом у больных псориазом и здоровых лиц генотипы встречались с близкой частотой: C/G - у 18 больных псориазом (40,0% ) и у 20 здоровых (44,4%); C/C - у 16 больных псориазом (35,6%) и у 14 здоровых (31,1%); генотип G/G - у 11 больных псориазом и у 11 здоровых (24,4%). Полиморфизм rs3213094 в гене IL-12B характеризовался следующими вариантами: А/А, G/G и A/G. Наиболее часто регистрировался генотип G/G, который был зарегистрирован у 26 больных псориазом (57,8%) и у 25 здоровых добровольцев (55,6%). На втором месте по частоте регистрации у обследованных был гетерозиготный генотип A/G, который встречался у 15 больных псориазом (33,3%) и у 18 здоровых лиц (40,0%). Генотип А/А был наиболее редким и идентифицировался у 4 больных псориазом (8,9%) и у 2 здоровых добровольцев (4,4%). В результате изучения полиморфизма rs17728338 в гене TNIP1 у обследованных были идентифицированы два вида генотипов: A/G и G/G. Гомозиготный генотип G/G встречался у 32 больных псориазом (71,1%) и у 40 здоровых (88,9%); гетерозиготный генотип A/G был зарегистрирован у 13 больных псориазом (28,9%) и у 15 здоровых лиц (33,3%). Полиморфизм rs9304742 гена ZNF816A характеризовался наличием трех генотипов: C/C, C/T T/T; при этом как у больных псориазом, так и у здоровых данные генотипы встречались с близкой частотой. Так, генотип C/C был зарегистрирован у 4 больных (8,9%) и у 6 здоровых (13,3%); генотип C/T регистрировался у 17 больных псориазом (37,8%) и у 19 здоровых (42,2%); генотип T/T встречался наиболее часто и был отмечен у 24 больных псориазом (53,3%) и у 20 здоровых (44,4%). В результате изучения полиморфизма rs27524 гена ERAP1 были идентифицированы генотипы А/А, G/G, A/G; при этом наиболее частым в выборке обследованных был гетерозиготный генотип A/G, который встречался у 25 больных псориазом (55,6%) и у 21 здорового добровольца (46,7%). На втором месте по частоте регистрации был гомозиготный генотип G/G; данный генотип был зарегистрирован у 18 больных псориазом (40,0%) и у 19 здоровых добровольцев (42,2%). Генотип А/А был зарегистрирован у 2 больных псориазом (4,4%) и у 5 здоровых добровольцев (11,1%). Результаты идентификации двух полиморфизмов (rs8016947 и rs12720356) методом ПДРФ В результате проведения ПДРФ-анализа в обследованной выборке пациентов были идентифицированы 2 полиморфизма: полиморфизм rs1272035 в гене TYK2 и полиморфизм rs8016947 в гене NFKBI. Полиморфизм rs1272035 в гене TYK2 характеризовался наличием двух генотипов: гомозиготного генотипа Т/Т и гетерозиготного генотипа Т/G. Гомозиготный генотип Т/Т встречался у 43 больных псориазом (95,6%) и у 35 здоровых лиц (77,8%). Гетерозиготный генотип Т/G был зарегистрирован у 2 больных псориазом (4,4%) и у 10 здоровых (22,2%). Полиморфизм rs8016947 в гене NFKBI был отмечен тремя генотипами: гомозиготными G/G и T/T и гетерозиготным - G/T. Генотип G/T в выборке обследованных встречался наиболее часто: у 26 больных псориазом (57,8%) и у 24 здоровых лиц (46,2%). Генотип G/G был вторым по частоте регистрации в выборке и обнаруживался у 14 больных псориазом (31,1%) и у 13 здоровых (28,9%). Генотип T/T был наиболее редким и выявлялся у 5 больных псориазом (11,1%) и у 8 здоровых (17,8%). Достоверных отличий между частотой встречаемости отдельных генотипов между больными псориазом и здоровыми на данном этапе исследования выявлено не было, что может быть объяснено относительной малочисленностью выборки. Исключение составил ген TYK2: rs1272035. Гомозиготный ге Вестник дерматологии и венерологии Научные исследования л 89 нотип Т/Т значительно чаще встречался у больных псориазом (95,6%) в сравнении со здоровыми лицами (77,8%) (OR = 6.1 ± 4.9; х2 = 6,0; р = 0,01), что позволяет рассматривать носителей данного генотипа как лиц с повышенной предрасположенностью к развитию псориаза, а сам генотип TYK2-T/G - как фактор риска в отношении развития псориаза. Напротив, гетерозиготный генотип Т/G значительно чаще встречался у здоровых (22,2%) в сравнении с больными псориазом (4,4%) (OR = 0,16 ± 0,13; X2 = 6,1; р = 0,01). Заключение Несмотря на множество разработанных и внедренных в последние годы методов генотипирования SNP, универсального метода для определения различных генетических маркеров заболевания не существует. С целью проведения генотипирования маркеров предрасположенности к развитию псориаза нами был выбран метод аллель-специфической гибридизации в формате ПЦР в реальном времени, обладающий преимуществами в сравнении с другими молекулярными методами, применяемыми для идентификации SNP: высокой специфичностью реакции за счет использования гибридизационных зондов, снижением риска контаминации за счет исключения постамплификационных манипуляций с продуктом амплификации, экономией времени и сокращением материальных затрат на выполнение исследований, возможностью автоматизации и стандартизации ПЦР в реальном времени. В результате применения метода аллель-специфи-ческой гибридизации в формате ПЦР в реальном времени у обследованных лиц (45 больных псориазом и 45 здоровых добровольцев) были установлены генотипы 11 из 13 изучавшихся маркеров предрасположенности к псориазу, описанных в зарубежной литературе как маркеры заболевания; установлена частота их встречаемости у больных псориазом и здоровых: (rs4649203 (ген IL-28RA), rs11209026 (ген IL-23R), rs610604 (ген TNFAIP3), rs514315 (ген SERPINB8), rs9304742 (ген ZNF816A), rs17728338 (ген TNIP1), rs13190932 (ген TRAF3IP2), rs2235617 (ген ZNF313), rs27524 (ген ERAP1), rs702873 (ген REL), rs3213094 (ген IL-12B). rs9304742. Генотип двух SNP (rs12720356 (ген TYK2), rs8016947 (ген NFKBI)) методом аллель-специфиче-ской гибридизации установить не удалось, что могло быть обусловлено сложной структурой нуклеотидной последовательности ДНК, окружающей данные SNP-маркеры, в связи с чем подобранные зонды работали неэффективно. Для изучения полиморфизмов фрагментов генов rs12720356 (ген TYK2), rs8016947 (ген NFKBI) протокол исследования был изменен: для изучения данных полиморфизмов был применен ПДРф-анализ, обладающий высокой точностью, воспроизводимостью, не требующий подбора аллель-специфических зондов и применения дорогостоящего оборудования. В результате проведенных работ впервые на российской выборке пациентов был получен массив экспериментальных данных о структуре и частоте встречаемости генотипов в соответствующих позициях 13 генов, ассоциированных с предрасположенностью к развитию псориаза. Полученные результаты подлежат подробному статистическому анализу на дальнейших этапах исследования при увеличении выборки больных псориазом не менее чем до 500 человек и выборки здоровых - не менее чем до 150 человек. На настоящем этапе исследования достоверных отличий между частотой встречаемости отдельных генотипов между больными псориазом и здоровыми выявлено не было, что может быть объяснено относительной малочисленностью выборки. Исключение составил ген TYK2: rs1272035. Гомозиготный генотип Т/Т значительно чаще встречался у больных псориазом (95,6%) в сравнении со здоровыми лицами (77,8%) (OR = 6.1 ± 4.9; х2 = 6,0; р = 0,01), что позволяет рассматривать носителей данного генотипа как лиц с повышенной предрасположенностью к развитию псориаза, а сам генотип TYK2-T/G - как фактор риска в отношении развития псориаза. Напротив, гетерозиготный генотип Т/G значительно чаще встречался у здоровых (22,2%) в сравнении с больными псориазом (4,4%) (OR = 0,16 ± 0,13; X2 = 6,1; р = 0,01). I

About the authors

A A MINEYEVA

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology Ministry of Healthcare of the Russian Federation

O S KOZHUSHNAYA

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology Ministry of Healthcare of the Russian Federation

L F ZNAMENSKAYA

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology Ministry of Healthcare of the Russian Federation

V V CHIKIN

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: chikin@cnikvi.ru

N V FRIGO

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology Ministry of Healthcare of the Russian Federation

References

Supplementary files