Methods for the determination of M class anti-T. pallidum antibodies for early diagnostics of syphilis

Full Text

При заражении сифилисом проникновение, пер-систенция и размножение возбудителя заболевания, T. pallidim, в организме хозяина приводят к активации механизмов как врожденного неспецифического, так и адаптивного, антиген-опосредованного иммунного ответа. В реализации механизмов иммунного ответа макроорганизма на инфекционный агент принимают участие множество разнообразных медиаторов клеточного обмена (провоспалительные и регуляторные интерлейкины, факторы роста и другие олигопептиды), повышенное содержание которых может определяться локально в очагах развития инфекции или в циркулирующей крови. Содержание указанных пептидов отражает выраженность защитной реакции макроорганизма, однако показатели их качественного и количественного содержания не являются характерными маркерами по отношению к антигенам возбудителя, вследствие чего они не могут служить для целей его идентификации или дифференциальной диагностики инфекционных заболеваний [1—3]. Эффекторные механизмы адаптивного (приобретенного) иммунного ответа макроорганизма на антигенную стимуляцию включают в себя гуморальное и клеточное звенья, соотношение этих элементов в протективном иммунитете при инфекциях во многом зависит от биологических свойств возбудителя заболевания [2—4]. Сифилис, вызываемый Treponema pallidum, относится к бактериальным инфекциям; реакции адаптивного иммунитета при этом заболевании осуществляются с участием гуморального звена, проявлением чего является выработка плазматическими клетками организма специфических антител, направленных против соответствующих антигенов возбудителя заболевания [2, 3, 6—22]. В соответствии с современными представлениями гуморальный ответ при сифилисе дебютирует появле нием иммуноглобулинов класса M против наиболее иммуногенных и специфичных антигенов возбудителя. Антитела класса M имеют молекулярную массу порядка 970 кДа; по своей природе молекула IgM представляет собой пентамер, состоящий из 5 одинаковых субъединиц, каждая из которых сформирована двумя тяжелыми (|j) и двумя легкими (к или X) аминокислотными цепями (рисунок). На одном конце каждой субъединицы иммуноглобулина M имеется по два антиген-распознающих Fab-фрагмента, способных за счет особой последовательности аминокислот своего вариабельного участка специфически распознавать и связывать определенный антиген, против которого он синтезирован. Другой конец субъединицы IgM имеет Fc-участок, благодаря которому 5 радиально расположенных субъединиц объединяются в единую структуру особым joint-белком. Эволюционно антитела класса M относятся к наиболее древнему классу защитных антител. В сыворотке крови IgM составляют до 5—10% от общего количества иммуноглобулинов; их биологическая функция состоит в максимальном связывании чужеродного антигена и подготовке его для последующего удаления из организма с привлечением фагоцитирующих клеток. Благодаря своему строению IgM могут связывать до 10 молекул антигена одновременно. Крупная величина молекулы и особенности структуры Fc-участков препятствуют проникновению IgM через тканевые барьеры и сосудистые мембраны (в том числе через плаценту от матери в кровоток плода) [23—26]. Иммуноглобулины класса M определяются в крови уже на 10—14-й день после проникновения T. pallidum в организм человека, максимальное же их содержание у больных сифилисом приходится на 6—9-ю неделю заболевания [26—29]. После успешного лечения антибактериальными препаратами специфические 16 L № 1, 2013 IgM у больных ранними формами сифилиса относительно быстро (через 3—12 месяцев) элиминируют из кровотока [24, 30—33]. без лечения содержание иммуноглобулинов класса М в крови больных сифилисом постепенно начинает снижаться и происходит переключение синтеза IgM на выработку антител класса G [2, 3, 34]. Иммуноглобулины класса G в сравнении с IgM являются более мелкими белками с молекулярной массой 150 кДа. по своему строению они соответствуют одной из субъединиц IgM, в которой тяжелые цепи в структуре молекулы представлены y-формами. Каждая молекула IgG способна связывать по две молекулы антигена. за счет меньшей величины и свободного Fc-фрагмента иммуноглобулины класса G являются более мобильными, они хорошо проникают через сосудистые мембраны, некоторые тканевые барьеры и плаценту [23, 25]. IgG составляют до 75% общего пула иммуноглобулинов крови, их биологическая функция заключается в специфическом связывании антигена в труднодоступных для других крупных молекул иммуноглобулинов участках макроорганизма. Специфические иммуноглобулины класса G в кровотоке больных сифилисом появляются более поздно, в конце 3-й или на 4-й неделе после заражения. Содержание специфических IgG постепенно увеличивается, достигает максимальной выраженности через 1—1,5 года, после чего несколько снижается, подвергаясь волнообразным колебаниям в зависимости от активности инфекционного процесса [24, 26, 28, 34]. Количество специфических IgG в циркулирующей крови после адекватно проведенного лечения снижается медленно, они продолжают определяться в течение десятков лет или пожизненно [30—34]. Кроме перечисленных видов антител в гуморальном иммунитете при сифилисе принимают участие иммуноглобулины класса А, которые могут быть представлены в виде мономеров и димеров (соединенных между собою двух субъединиц, напоминающих IgG), в которых тяжелые цепи представлены а-формами. В сыворотке крови содержание ^А может достигать 15—20% от общего пула иммуноглобулинов в основном в виде двухвалентных мономеров. Антитела класса A секретируются на поверхности слизистых оболочек пищеварительного тракта, дыхательных, половых и мочевыделительных путей в виде четырехвалентных димеров; они усиливают защитные барьерные функции слизистых оболочек. IgA не способны проникать в кровоток ребенка через систему плацентарного кровообращения и могут быть использованы для диагностики врожденного сифилиса [3, 24, 35, 36]. Для выявления сифилиса при обследовании населения в настоящее время широко используются иммунологические (серологические) исследования, основанные на выявлении в жидких средах организма (крови или цереброспинальной жидкости) специфиче ских иммуноглобулинов, направленных против характерных для возбудителя антигенных детерминант. Используемые лабораторные методы позволяют выявлять суммарный пул специфических антител классов M, G и A или дифференцированно антитела класса G или M [9, 10, 13, 14—22, 25, 37—39]. Для выявления пула специфических антител (суммарно) при сифилисе применяют такие лабораторные методы, как иммуноферментный анализ (ИфА), реакция пассивной гемагглютинации (РпГА), реакция непрямой иммунофлюоресценции (РИф), иммуно-блоттинг (Иб), иммунохроматографические (ИХГИ) и иммунохемилюминесцентные (ИХЛИ) исследования [9, 10, 18, 19; 21, 22, 39, 41, 42]. Изучению клинической информативности указанных методов исследования в xx веке было посвящено значительное количество научных работ. Дифференцированно определять в биологических жидкостях больного сифилисом содержание специфических антител класса G или M позволяют ИфА и иммуноблоттинг за счет использования в качестве вторичных антител (конъюгатов) моноклональных антител к несвязанному Fc-фрагменту молекулы IgG или к р-форме тяжелой аминокислотной цепи, характерной для IgM [28, 34, 43]. Диагностическая информативность выявления специфических IgG при сифилисе изучена в большей степени, и это обусловлено более ранней разработкой технологии получения моноклональных антител для выявления иммуноглобулинов класса G. Клинические исследования по изучению диагностической информативности выявления IgM при сифилисе в научной литературе представлены в существенно меньшей степени, что связано с проблемами, связанными с разработкой высокочувствительных лабораторных технологий определения указанного класса антител. при создании диагностических наборов реагентов для выявления IgM на основе ИФА традиционно используют два подхода. первый из них (классическая сэндвич-технология) заключается в связывании антигеном Т. pallidum, фиксированном на твердой фазе, специфических иммуноглобулинов всех классов, содержащихся в исследуемом образце, с последующим выявлением среди них IgM с помощью конъюгата на основе моноклональных сывороток против р-формы тяжелой цепи [28, 34, 44]. Недостаточная чувствительность описанной методики определения специфических IgM обусловлена конкуренцией между антителами разных классов за специфические сайты связывания антигеном на твердой фазе при существенно более низком содержании антител класса М в сыворотке крови по сравнению с антителами классов G и А [38, 40]. Другой подход состоит в связывании на первом этапе моноклональными сыворотками к р-форме тяжелой цепи, сорбированными на твердой фазе, всех ■ Вестник дерматологии и венерологии Обзор литературы А 17 иммуноглобулинов класса М из исследуемого образца (технология «ловушки для антител», antibody capture ELISA) с последующим выявлением среди них специфических антител к антигенам возбудителя сифилиса. Это более чувствительный метод исследования, но и при нем имеются трудности обеспечения высокой чувствительности исследования, обусловленные количественными соотношениями антител различной специфичности в общем пуле иммуноглобулинов класса М [8, 28, 38]. В ряде исследований была в сравнительном аспекте изучена клиническая информативность определения IgM методом ИФА. Так, Ляховым В.ф. и др. (1990) при обследовании 73 больных разными клиническими формами сифилиса с применением разработанных авторами оригинальных наборов реагентов для ИФА^ и ИФА^ было установлено, что в крови больных первичным сифилисом наблюдается максимальное содержание IgM при минимальном уровне IgG. При массовой диссеминации бледных трепонем, наблюдаемой при вторичном сифилисе, происходит снижение содержания IgM в крови и значительное нарастание специфических IgG антител. Авторы отметили, что на начальных этапах развития инфекционного иммунитета при сифилисе происходит образование антител к видоспецифическим белковым антигенам T. pallidum, а затем вырабатываются антитела к груп-по- и типоспецифическим детерминантам, то есть сначала появляются антитрепонемные, а затем антилипо-идные антитела [28]. В исследовании Чепурченко Н.В. и др. (2001) была показана разная чувствительность ИФА^ при диагностике отдельных клинических форм у 190 больных сифилисом: при первичном — 78,8%, вторичном — 51%, скрытых формах — 24,3%; при этим клиническая чувствительность ИФА, „ составила 78,8, 100 и 100% со- IgG ’ ’ ответственно. Специфичность результатов исследования в ИФА^ составила 100%, а ИФА^ — 99,4% [45]. Несколько более высокие показатели клинической чувствительности были получены при исследовании 304 образцов сыворотки, полученных от больных сифилисом: при первичном — 89,1%, вторичном — 82,4%, всех скрытых формах — 15,4—34,4% [42]. С представленными данными согласуются результаты исследования Schmidt B.L. et al. (2000), проведенного с 52 образцами сыворотки крови больных первичным сифилисом, которые показали отсутствие антител к антигенам T. pallidum в реакции микрогемаг-глютинации (MHA-TP), являвшейся основным отборочным тестом в ряде стран Европы. Исследование этих образцов продемонстрировало положительные результаты в ИФА^ с двумя наборами реагентов — в 22,6—63,4%, в ИФА^^ с шестью различными наборами реагентов — в 48,5—76,9%, в ИФА^ с одним набором реагентов — в 86,5%. Авторами указано на ограничение использования ИФА^ в качестве отборочного теста для скрининга сифилиса из-за недостаточно высокой специфичности его результатов (91%) [38]. Отличающиеся результаты диагностической информативности ИФА^ были получены в исследовании Киселевой Г.А. и соавт. (2000) при сравнительных испытаниях 3 наборов реагентов для выявления сифилиса в ИФА^ разных производителей. Кроме того, авторами показана высокая клиническая чувствительность ИФА^ при ранних клинических формах заболевания: при первичном — 80—100%, при вторичном — 88,9—100%, при скрытом раннем сифилисе — 48,3— 92,9%, при всех формах активного сифилиса и у больных с серорезистентностью — 52,9—75,8%. При этом были установлены высокие показатели клинической специфичности исследований — 82—100% [47]. При обсуждении современных методов исследования, применяемых для диагностики сифилиса, авторы характеризуют чувствительность ИФА^ при первичном сифилисе на уровне 78—93%, вторичном — 51 — 85%, скрытых формах — 24,3—64% [48—50]. После успешно проведенного лечения больных свежими формами сифилиса отрицательные результаты ИФА^ определяются через 6 и 12 месяцев в 71 и 92% случаев соответственно [51], при этом некоторые авторы отмечают персистенцию в крови антител указанного класса до 18 месяцев после окончания терапии [52]. Рядом исследователей было показано выявление в крови иммуноглобулинов класса М как маркера присутствия в макроорганизме возбудителя у больных с реинфекцией и неудачами проведения антибактериальной терапии [20, 28, 53, 54]. Недостаточно высокие показатели диагностической информативности (чувствительности и специфичности) отечественных наборов реагентов для ИФА^ вызывают недовольство клинических специалистов, использующих результаты указанных исследований для диагностики сифилиса [48, 55—57]. Одним из высокочувствительных методов исследования специфических антител класса M является реакция иммунофлюоресценции (РИФ) [38, 40, 58]. Для осуществления РИФ^ из образца сыворотки крови либо выделяют 19S фракцию (IgM антитела), используя ионообменную хроматографию или ультрацентрифугирование в градиенте плотности, либо удаляют фракцию IgG антител [38, 40, 59]. Schmidt B.L. et al. (1994) при сравнительном изучении разных методов выявления специфических IgM при сифилисе было убедительно показано преимущество применения 19S IgM FTA-abs: положительные результаты выявления IgM при использовании этого метода были получены в 100% случаев у пациентов с первичным и вторичным и в 96,0% — с ранним скрытым сифилисом, в то время как в ИФА^ (Capture Elisa) наблюдали 100, 96,3 и 89,8% положительных результатов соответственно [40]. В более поздней рабо- 18 L № 1, 2013 те авторами были подтверждены более высокие показатели клинической чувствительности метода 19S IgM FTA-abs при диагностике сифилиса (90,4%) по сравнению с FTA-abs (44%) [38]. В работе Гусевой С.Н. и Данилова С.И. (2004) методом IgM-РИФ.^ исследованы образцы крови 55 беременных, у которых при первичном обследовании на сифилис были получены положительные результаты в одном из иммунологических тестов (КСР, РИФа6с и РИБТ). Авторами предложен модифицированный способ определения специфических IgM для верификации результатов исследования: на подготовительном этапе из образцов сыворотки крови удаляется сывороточный IgG (до 95%) путем его осаждения на стафилококковом реагенте, содержащем сухой белок А. Исследование в IgM-РИФ.^ позволило выявить положительные результаты в 14 (25%) случаях, что явилось основанием для постановки диагноза скрытого раннего сифилиса. Авторы рекомендовали разработанный метод исследования для внедрения [58, 60], однако до настоящего времени широкого применения в практическом здравоохранении он не получил. ЗАО «ЭКОлаб» была предложена методика IgM-РИФабс с предварительной обработкой образцов сыворотки крови RF-сорбентом (rheumatoid factor), предотвращающим неспецифическое влияние на результаты исследования ревматоидного фактора сыворотки крови и предупреждающего вытеснение из реакции специфических антител класса М антителами класса G. при исследовании образцов сыворотки крови 144 больных сифилисом и 100 здоровых лиц в ИФА^ и IgM-РИФ.^ было получено полное совпадение результатов [61]. Клиническая доступность предложенного метода исследования и разработанный для этого диагностический набор реагентов позволяют проводить расширенные клинические исследования для оценки его диагностической информативности. Исследование образцов сыворотки крови больных с клиническими проявлениями врожденного сифилиса показало высокую клиническую чувствительность выявления антител класса М в относительно новом методе исследования — IgM иммуноблоттинге — 92% [62]. Изучение образцов сыворотки крови в IgM иммуноблоттинге было проведено Meyer M.P. et аі. (1994) у новорожденных с врожденным сифилисом с клиническими проявлениями и без проявлений, а также у детей без сифилиса, рожденных от перенесших сифилис серопозитивных и не болевших сифилисом матерей. положительные результаты определения IgM к антигену TpN47 наблюдали в 92, 83, 10 и 0% случаев; кроме этого, у новорожденных была установлена различная частота выявления антител в отношении антигенов T. pallidum с разной молекулярной массой (от 15 до 110 кДа) [63]. В настоящее время исследователями предложены новые лабораторные методы и соответствующее аппаратное обеспечение для определения специфических IgM при диагностике сифилиса, в том числе с использованием технологии проточной флюорометрии (xMAP) и иммуноферментного исследования на основе белковых микробиочипов [50, 64, 65]. Используя наборы реагентов BioPlex на основе калиброванных микросфер, Gomes E. et al. (2010) показали более высокую чувствительность иммунологического выявления специфических антител класса IgM с регистрацией результатов лазерным проточным флюорометрическим датчиком в сравнении с методикой их исследования в ИФА^ [66]. Таким образом, для ранней диагностики инфекционных заболеваний, в том числе и сифилиса, а также дифференциальной диагностики случаев врожденного сифилиса или реинфекции показано лабораторное исследование образцов сыворотки крови пациентов с выявлением в первую очередь специфических иммуноглобулинов класса M. Для определения специфических IgM разработаны различные методики исследования, но их чувствительность зависит от стадии инфекционного процесса и качества используемых диагностических наборов реагентов. применение результатов определения специфических антител класса M к антигенам T. pallidum при диагностике сифилиса регламентировано многочисленными алгоритмами обследования пациентов [8—10, 25, 29, 34, 37, 40], а также действующими методическими рекомендациями и стандартами [11—14, 16, 17, 20—22, 39, 41, 50]. появление новых методов исследования трепонемоспецифических IgM требует клинической оценки их диагностической информативности на репрезентативной выборке пациентов.

About the authors

S V Rotanov

The Russian National Research Medical University named after N.I. Pirogov; State Research Center of Dermatovenerology аnd Cosmetology Ministry of Health Care of the Russian Federation

Email: rotanov@cnikvi.ru

R N Chuprov-Netochin

State Research Center of Dermatovenerology аnd Cosmetology Ministry of Health Care of the Russian Federation

F A Ermatova

The Russian National Research Medical University named after N.I. Pirogov

References

Supplementary files