Experience of molecular typing and phylogenetic analysis of N. gonorrhoeae strains in the Russian Federation

Full Text

Одним из современных инструментов эпидемиологического контроля над распространением инфекций, передаваемых половым путем (Иппп), в том числе гонококковой инфекции, являются методы типирования, осуществляемые с использованием молекулярно-биологических методов [1—4]. Общие принципы и технологические подходы к молекулярному типированию различных микроорганизмов во многом сходны. Они основаны на выявлении у микроорганизмов комплекса признаков, наличие или отсутствие которых у отдельного штамма является его уникальной характеристикой. Чем больше одинаковых признаков у двух или более штаммов, тем ближе их генетическое родство. В качестве признаков, характеризующих свойства отдельных штаммов бактерий, используют структуру генов (их первичную нуклеотидную последовательность) [5—6]. К настоящему времени биология N. gonorrhoeae достаточно хорошо изучена [7—9]. Геном микроорганизма содержит около 2,2 млн пар оснований, включает 2729 генов, из которых 2662 кодируют белки N. gonorrhoeae. функции многих генов еще не известны, однако среди них можно выделить уникальные участки, специфичные для данного рода, вида или подвида микроорганизмов [10—11]. Для более эффективного различия штаммов N. gonorrhoeae, а также установления родства сравниваемых штаммов необходимо осуществлять их молекулярное типирование по нескольким генам. при выборе генов для молекулярного типирования N. gonorrhoeae необходимо учитывать степень их вариабельности. В исследуемой популяции каждый ген должен встречаться в достаточном числе аллелей. Одним из известных и признанных методов молекулярного типирования N. gonorrhoeae является NG-MAST-типирование (Neisseria gonorrhoeae — multiantigen-sequence-typing), основанное на секвенировании фрагментов двух генов N. gonorrhoeae — porB гена, кодирующего белок поринового канала, и tbpB гена, кодирующего трансферринсвязывающий белок [12]. Данный метод, обладающий высокой дискриминирующей способностью, позволяет регистрировать сиквенс-типы N. gonorrhoeae в международной базе данных NG-MAST (http://www.ng-mast.net), при этом впервые обнаруженным сиквенс-типам присваиваются новые номера. Типирование N. gonorrhoeae методом NG-MAsT позволяет определить сиквенс-тип штамма N. gonorrhoeae, представляющий индивидуальную генетическую характеристику изучаемого штамма. Информация о сиквенс-типах N. gonorrhoeae, каждый из которых имеет свой индивидуальный номер, хранится в международной базе данных NG-MAST и позволяет проследить пути распространения каждого отдельного штамма внутри отдельных областей одного государства и между государствами. На основании результатов молекулярного типирования штаммов N. gonorrhoeae методом NG-MAST может быть проведен филогенетический анализ, позволяющий оценить степень родства между отдельными штаммами и популяциями микроорганизмов, определить направления их эволюционного преобразования; зная происхождение штаммов (географическое), выяснить возможные пути их распространения в пределах отдельных регионов и между регионами. Целью настоящего исследования явилась оценка генетического разнообразия и изучение возможных путей распространения российской популяции штаммов N. gonorrhoeae с использованием методов молекулярного типирования и филогенетического анализа. Материал и методы Для оценки генетического разнообразия штаммов N. gonorrhoeae, циркулирующих на территории Российской Федерации, были проведены молекулярное типирование и филогенетический анализ 429 штаммов N. gonorrhoeae. В исследовании использовались чистые культуры штаммов N. gonorrhoeae, полученные из субъектов Российской Федерации в 2011—2012 гг. от больных с лабораторно подтвержденным диагнозом «гонококковая инфекция нижних отделов мочеполового тракта», «гонококковая инфекция верхних отделов мочеполового тракта». Определение нуклеотидной последовательности генов por и tbp N. gonorrhoeae осуществлялось поэтапно путем: выделения ДНК N. gonorrhoeae из биообразцов (чистых культур N. gonorrhoeae); амплификации ДНК вариабельных участков генов por и tbp N. gonorrhoeae; детекции и визуализации продуктов амплификации ДНК генов por и tbp N. gonorrhoeae (оценочный форез); осаждения продуктов амплификации ДНК генов por и tbp N. gonorrhoeae; проведения пЦР с мечеными терминирующими нуклеотидами; осаждения продуктов пЦР; секвенирования генов por и tbp N. gonorrhoeae на секвенаторе ABI 3730 (Applied Biosystem, США) с использованием программного обеспечения 3730 Data collection v 3.0 и дальнейшей обработкой полученных данных (raw data) в программе Sequencing Analysis 5.3.1; анализа нуклеотидных последовательностей генов por и tbp N. gonorrhoeae с помощью программ Vector NTI 9.1 и DNA Star 7.1.0. Амплификация и секвенирование исследуемых генов (por и tbp) осуществлялись с использованием праймеров (табл. 1), опубликованных на веб-сайте www.ng-mast.net. Условия амплификации генов por и tbp приведены в табл. 2. после определения нуклеотидных последовательностей генов por и tbp N. gonorrhoeae для них были назначены порядковые номера аллелей и сиквенс-типы в международной базе данных NG-MAST. при полном совпадении нуклеотидной последовательности исследуемого гена с одним из имеющихся в базе данных аллелей ему присваивался номер данного аллеля. при несовпадении результатов секвенирова-ния с имеющимися аллелями оригинальную хроматограмму секвенирования направляли в международную базу данных NG-MAST для присвоения номера новому аллелю. по полученной комбинации номеров аллелей генов por и tbp определяли сиквенс-тип штамма N. gonorrhoeae. В случае отсутствия в базе данных искомой комбинации аллелей данные направляли в международную базу NG-MAST для присвоения номера новому сиквенс-типу. Вестник дерматологии и венерологии Научные исследования л 15 I ТАБЛИЦА 1 Последовательность праймеров, используемых для молекулярного типирования генов por и tbp N. gonorrhoeae Название Последовательность Por forward 5’ 350CAA GAA GAC CTC GGC AA366 3’ Por reverse 5’ 1086CCG ACA ACC ACT TGG T1071 3’ TbpB forward 5’ 1098CGT TGT CGG CAG CGC GAA AAC1118 3’ TbpB reverse 5’ 1686TTC ATC GGT GCG CTC GCC TTG1666 3’ I ТАБЛИЦА 2 Условия проведения реакции амплификации для por- и tbp- генов N. gonorrhoeae Рекомендованные условия амплификации ген pûr ген tbp В 95° С — 4 мин. 95° С — 4 мин. 95° С — 30 с. 95° С — 30 с. 58° С — 30 с. 69° С — 30 с. 72°С — 1 мин. 72°С — 1 мин. 30 циклов 30 циклов 72°С — 10 мин. 72°С — 10 мин. 4°С — хранение 4°С — хранение Филогенетический анализ штаммов N. gonorrhoeae, циркулирующих на территории Российской Федерации, был проведен поэтапно путем: определения нуклеотидной последовательности генов por и tbp N. gonorrhoeae методом секвенирования; выравнивания последовательностей вариабельных участков генов por и tbp N. gonorrhoeae с целью установления позиционной гомологии нуклеотидов в разных последовательностях с помощью программы AlignX из пакета программ Vector NTI 9.1.0, а также с использованием сервера clustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/ clustalw2/); построения филогенетического дерева для выровненных последовательностей генов por и tbp N. gonorrhoeae при помощи программ AlignX из пакета программ Vector NTI 9.1.0 и MEGA 5; выявления наиболее представительных и наименее представительных кластеров штаммов N. gonorrhoeae. Результаты и обсуждение В результате проведенных исследований были получены молекулярно-эпидемиологические данные о вариантах штаммов (сиквенс-типах) N. gonorrhoeae, циркулирующих на территории Российской Федерации, и степени их генетической изменчивости. Всего на территории РФ был выявлен 171 вариант сиквенс-типов (ST) штаммов N. gonorrhoeae (рис. 1). В исследованной выборке было выявлено 209 (48,7%) штаммов N. gonorrhoeae, имеющих известные сиквенс-типы, описанные в международной базе дан ных NG-MAST, и 220 (51,3%) штаммов, представленных с новыми сиквенс-типами, новыми комбинациями известных аллелей и неизвестными аллелями por и tbp генов (рис. 2). Данные о новых сиквенс-типах были переданы в международную базу NG-MAST, где им были присвоены соответствующие порядковые номера. Среди выявленных штаммов N. gonorrhoeae встречались как штаммы, представленные единичными сиквенс-типами (n = 94; 21,9%), так и штаммы с повторяющимися сиквенс-типами (n = 335; 78,1%); при этом группы штаммов с одинаковым сиквенс-типом, который встречался от 2 до 7 раз (n = 227), составили 52,9% и группы штаммов с одинаковым сиквенс-типом, который встречался больше 8 раз (n = 108), — 25,2% (рис. 3). Доминирующими, т. е. встречающимися 8 раз и более, были сиквенс-типы: 228 (n = 26), 807 (n = 14), 5714 (n = 11) и 285 (n = 9) (рис. 4). Изучение географического распространения сик-венс-типов на территории РФ показало, что общие сиквенс-типы штаммов N. gonorrhoeae были распространены в городах Южного, Северо-Кавказского, Северо-Западного, Центрального, приволжского и Сибирского федеральных округов РФ (табл. 3). Анализ распространенности сиквенс-типов N. gonorrhoeae в разных странах мира, проведенный на основании данных литературы [13—17] (см. табл. 3; рис. 5), показал, что варианты сиквенс-типов, входящие в общероссийский пул, встречаются также в дру- 16 L № 2, 2012 ■63 "225 ■ 228 >285 ■343 «387 ■ SO? чмз ■1152 ■ 1241 ■ 1523 *1544 ■154$ *1751 *1335 ■ЇЙЗЗ ■2857 »2858 ■2861 *2905 ■ 3056 шгггг ■ 5327 "5705 ■ 57ÜÜ 45707 ■ 5708 *5711 ■ 5713 *5714 ■ 571S ■ 5731 ■ 5734 "5742 ■ 5743 ■ 5744 ■ 5747 *581Є ■5Ö17 "5Є1Є ■5820 5823 ■5824 п 5825 5855 "5857 ■ 5921 -Î922 5926 -5527 5923 5929 5932 5937 5940 î£41 5943 5 948 595S 6160 Единичны* ST Рис. 1. Сиквенс-типы штаммов N. gonorrhoeae, циркулирующих на территории Российской Федерации гих странах мира (Европа, Азия, Северная Америка, Австралия). при этом наибольшая распространенность общих сиквенс-типов наблюдается в Европе, что может быть обусловлено географической близостью европейских стран к Российской Федерации и высокой миграционной активностью населения. Филогенетический анализ внутрипопуляционных генетических различий штаммов N. gonorrhoeae, полученных из различных регионов РФ, позволил выделить несколько важных особенностей. Установлено, что для популяций N. gonorrhoeae, приуроченных ко всей территории РФ и к отдельным субъектам РФ, характерна иерархичная структура кластерных построений. Кластеры, объединявшие родственные сиквенс-типы штаммов N. gonorrhoeae, по степени родства и сложности структуры делились на более мелкие субкластеры. Крупные кластеры включали несколько субкластеров. Филогенетический анализ штаммов N. gonorrhoeae, циркулирующих на территории РФ в целом, выявил 5 крупных, 9 средних и 13 мелких кластеров. Эволю-ционно выборка российских штаммов N. gonorrhoeae дивергировала в одном направлении, разбиваясь на кластеры и субкластеры, но при этом выделялся ■ Новые ST ■ Известные ST |Рис. 2. Распределение известных и новых сиквенс-типов штаммов N. gonorrhoeae, циркулирующих на территории Российской Федерации Вестник дерматологии и венерологии Количество ST Научные исследования л 17 і Рис. 3. Частота встречаемости единичных и повторяющихся сиквенс-типов N. gonorrhoeae Рис. 4. Распределение доминирующих сиквенс-типов в российской популяции штаммов N. gonorrhoeae 18 L № 2, 2012 I ТАБЛИЦА 3 Распространение общих сиквенс-типов N. gonorrhoeae в федеральных округах Российской Федерации и странах мира ST Федеральный округ России Страна Источник 63 Южный, Дальневосточный, Северо-Кавказский Англия Международная база данных NG-MAST 225 Северо-Западный, Северо-Кавказский Англия, Греция, Дания, Португалия, Шотландия, Германия, Франция, Гонконг, Тайвань, Япония, Австралия C. Florindo и соавт., 2010 M. Tanaka и соавт., 2011 A. Mavroidi и соавт., 2011 L. Monfort и соавт., 2009 W. Wong и соавт., 2008 228 Центральный, Южный, Северо-Западный, Сибирский, Уральский, Северо-Кавказский Англия, Франция, Германия Международная база данных NG-MAST 285 Центральный, Южный, Северо-Западный Англия Международная база данных NG-MAST 340 Сибирский, Уральский Тайвань, Англия, Канада, Франция, Гонконг, Китай Международная база данных NG-MAST 437 Уральский Корея, Франция, Тайвань Международная база данных NG-MAST 807 Центральный, Южный, Северо-Западный Приволжский, Северо-Кавказский Англия Международная база данных NG-MAST 1241 Центральный, Южный, Северо-Западный Северо-Кавказский Англия Международная база данных NG-MAST 1751 Южный, Сибирский Канада, Гонконг Международная база данных NG-MAST 2633 Дальневосточный, Северо-Кавказский Греция Международная база данных NG-MAST 2861 Южный, Дальневосточный, Приволжский Англия Международная база данных NG-MAST Австралия Рис. 5. Распространение общих сиквенс-типов штаммов N. gonorrhoeae в мире Вестник дерматологии и венерологии Научные исследования л 19 Рис. 6. Филогенетическое древо, рассчитанное для штаммов N. gonorrhoeae Приволжского федерального округа. Среди 55 штаммов N. gonorrhoeae, полученных из ПрФО, выявлено 26 сиквенс-типов. Наиболее представленными сиквенс-типами являются: 3158 (11%), 5714 (11%) и 5824 (9%). На дендрограмме хорошо выделяются 4 крупных и 3 мелких кластера, эволюционно удаленных друг от друга 20 к № 2, 2012 1 кластер, состоявший из 27 штаммов, который был эволюционно дистанцирован от остального массива штаммов. Учитывая, что входившие в состав данного кластера штаммы N. gonorrhoeae были выделены в основном в Южном федеральном округе, можно предположить, что штамм — предшественник (родоначальник) данного кластера мог быть привнесен в РФ извне. В результате филогенетического анализа штаммов N. gonorrhoeae, выделенных в пределах одного федерального округа, была установлена внутрипопуляцион-ная генетическая гетерогенность кластерных построений штаммов N. gonorrhoeae, индивидуальная для каждого федерального округа. На рис. 6 представлено филогенетическое древо, на котором отражена генетическая гетерогенность в популяции N. gonorrhoeae на примере Приволжского федерального округа. В результате филогенетического анализа была установлена генетическая близость между отдельными сик-венс-типами штаммов N. gonorrhoeae, циркулирующими внутри различных округов РФ. Это подтвердило результаты, полученные методом NG-MAST, свидетельствующие о возможности переноса этих сиквенс-типов между территориями РФ за счет миграционного компонента. Заключение В результате исследований, проведенных на большой выборке штаммов N. gonorrhoeae, были определены сиквенс-типы данных штаммов N. gonorrhoeae методом NG-MAST и осуществлен их филогенетический анализ. Выявлено значительное генетическое разнообразие штаммов N. gonorrhoeae, циркулирующих на территории Российской Федерации. Полученные данные могут свидетельствовать о высокой скорости накопления мутаций генов por и tbp среди российской популяции штаммов N. gonorrhoeae. В результате проведенных исследований была установлена генетическая близость отдельных сиквенс-ти-пов штаммов N. gonorrhoeae, выявлены общие и доминирующие сиквенс-типы штаммов N. gonorrhoeae, распространенные не только в различных федеральных округах Российской Федерации, но и за рубежом. Это свидетельствует о возможности переноса данных штаммов между территориями Российской Федерации и в Российскую Федерацию из-за рубежа за счет активной миграции населения (туризм, деловые поездки, миграция беженцев, военнослужащих и т. д.). Исследования показали, что изучение молекулярных особенностей и генетической изменчивости молекулярных типов возбудителя гонококковой инфекции N. gonorrhoeae является важным фактором обеспечения контроля над распространением гонореи на территории Российской Федерации, так как позволяет на регулярной основе осуществлять молекулярное наблюдение (мониторинг) и определять пути распространения отдельных сиквенс-типов штаммов N. gonorrhoeae на территории Российской Федерации. I

About the authors

V S Solomka

R N Chuprov-Netochin

N V Frigo

Email: frigo@cnikvi.ru

A A Kubanov

References

Supplementary files