Skin cytokine profile in patients with mycosis fungoides

Arfenya E. Karamova; Карамова Арфеня Эдуардовна; Alexandr А. Nikonorov; Никоноров Александр Александрович; Dmitry A. Verbenko; Вербенко Дмитрий Анатольевич; Lyudmila F. Znamenskaya; Знаменская Людмила Федоровна; Anastasiia Vorontsova; Воронцова Анастасия Александровна

doi:10.25208/vdv1202

Цитокиновый профиль кожи у больных грибовидным микозом

Авторы: Карамова А.Э.¹, Никоноров А.А.¹, Вербенко Д.А.¹, Знаменская Л.Ф.¹, Воронцова А.А.¹
Учреждения:
1. ФГБУ «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии» Минздрава России
Выпуск: Том 96, № 6 (2020)
Страницы: 14-19
Раздел: НАУЧНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Дата подачи: 28.12.2020
Дата принятия к публикации: 11.01.2021
Дата публикации: 15.12.2020
URL: https://vestnikdv.ru/jour/article/view/1202
DOI: https://doi.org/10.25208/vdv1202
ID: 1202

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Цель исследования: определить концентрации цитокинов в коже больных грибовидным микозом и оценить взаимосвязи со значением модифицированной шкалы оценки тяжести кожного поражения mSWAT.

Методы: с использованием технологии xMAP одновременно определяли концентрацию цитокинов: IL-1β, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22, IL-23, IL-25, IL-31, IL-33, IFN-γ, sCD40L, TNF-α. в биоптатах кожи 21 больного ранними (IA-IIA) стадиями грибовидного микоза и 4 здоровых лиц. Анализ и визуализация полученных данных проведены с использованием R Statistical Software for MacOS (версия 1.3.1056), свободная среда разработки программного обеспечения с открытым исходным кодом для языка программирования R.

Результаты: показано повышение уровня IL4 и TNFa в очагах поражения у больных ГМ по сравнению со здоровыми лицами (р= 0.025 и р= 0.012, соотвественно). С помощью корреляционного анализа выявлено формирование в коже больных ГМ цитокиновых сетей, не связанных со значением модифицированной шкалы оценки тяжести кожного поражения mSWAT. Обнаружена тенденция к отрицательной взаимосвязи шкалы mSWAT и IFNg (р=0.056)

Заключение: ни один из цитокинов в очагах поражения и визуально непораженной коже не был связан с величиной mSWAT.

Ключевые слова

грибовидный микоз, цитокины, интерлейкины, цитокины в коже

Полный текст

Введение

Грибовидный микоз — наиболее часто встречающееся заболевание из группы первичных Т-клеточных лимфом кожи, характеризующихся неконтролируемой пролиферацией малых и средних атипичных Т-лимфоцитов с формированием доминирующего клона в коже и по мере прогрессирования заболевания в лимфатических узлах, крови и внутренних органах [1, 2].

Злокачественная пролиферация Т-лимфоцитов при ГМ сопровождается изменением цитокинового профиля в коже больных: часть цитокинов интенсивно синтезируется и стимулирует пролиферацию атипичных клеток, в то время как синтез цитокинов — ингибиторов опухолевого роста угнетается, что способствует прогрессированию заболевания [3].

Цель исследования: определить концентрации цитокинов в коже больных грибовидным микозом и оценить взаимосвязи с клинической картиной заболевания.

Методы

Дизайн исследования

Одномоментное исследование.

Критерии соответствия

В исследование включали пациентов старше 18 лет с установленным диагнозом Т-клеточной лимфомы кожи — грибовидный микоз на ранних стадиях (IA — IIA), не получающих в момент включения системной иммуномодулирующей и/или иммуносупрессивной терапии.

Условия проведения

Исследование проводилось на базе Федерального государственного бюджетного учреждения «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Продолжительность исследования

В статье представлены результаты исследования, полученные в период с 2018 по 2020 г.

Материал и методы

В исследование последовательно включен 21 больной грибовидным микозом на ранних стадиях (IВ—IIA) и 4 здоровых добровольца, которые подписали форму информированного согласия на участие в исследовании. Возраст пациентов варьировал от 28 до 74 лет (средний — 55,8 года). Средняя продолжительность заболевания составила 14,6 года. У 11 больных (52,3%) была диагностирована стадия IB, у 10 больных (47,7%) в связи с выявленным увеличением групп лимфатических узлов при проведении ультразвукового исследования — IIA стадия. У всех больных присутствовали пятнистые и инфильтративно-бляшечные элементы, у 8 больных помимо пятен и бляшек наблюдались очаги пойкилодермии. Оценка тяжести поражения кожных покровов проводилась с применением клинического индекса оценки площади поражения BSA и модифицированной шкалы mSWAT [4, 5]. Площадь поражения составляла от 8 до 64% (в среднем 26,4%), значение модифицированной шкалы оценки тяжести кожного поражения mSWAT варьировало от 11 до 105 и в среднем составляло 39,9 балла.

У всех пациентов получен биоматериал из наиболее инфильтрированного очага пораженной и участка визуально непораженной кожи.

Все полученные образцы взвешивались на лабораторных весах в промаркированных пробирках объемом 1,5 мл типа «Эппендорф» (Axygen), затем гомогенизировались с помощью автоматизированной системы для дезагрегации тканей Medimachine (Becton Dickinson, США) в специальных одноразовых камерах Medicons (Becton Dickinson, США) в течение 2 мин c добавлением 1 мл фосфатного буфера (рH = 7,4) к каждому образцу с последующей фильтрацией через одноразовый фильтр с размером пор 50 мкм с целью предотвращения засорения проточной системы прибора.

Определение концентрации цитокинов в образцах проводилось на приборе Bio-Plex 200 (Bio-Rad) c использованием коммерческого набора реагентов Bio-Plex Pro Human Th17 Cytokine Panel 15-Plex (Bio-Rad), позволяющего одновременно определить содержание следующих цитокинов: IL-1â, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, IL-17F,
IL-21, IL-22, IL-23, IL-25, IL-31, IL-33, IFN-ã, sCD40L, TNF-á. Исследование каждого образца проводилось в дублях по 50 мкл суспензии согласно протоколу производителя с использованием автоматической станции отмывки микропланшетов Bio-Plex ProWash Station (Bio-Rad), шейкера для микропланшетов (Biosan). Для калибровки прибора использовали набор Calibrationkit (Bio-Rad). Учет результатов проводился автоматически в приложении Bio-PlexManager (Bio-Rad) в размерности пг/мл. Полученные значения пересчитывали в соответствии с первоначальным весом биоптата и выражали в пг/мг.

Этическая экспертиза

Исследование проведено в соответствии с требованиями Декларации Хельсинки, протокол исследования одобрен локальным Этическим комитетом.

Статистический анализ

Принципы расчета размера выборки: размер выборки предварительно не рассчитывался.

Методы статистического анализа данных: анализ и визуализация полученных данных проведены с использованием R Statistical Software or MacOS (версия 1.3.1056), свободная среда разработки программного обеспечения с открытым исходным кодом для языка программирования R. Оценка распределения данных проводилась при помощи критерия Шапиро — Уилка. Данные представлены в виде медианы (25–75) методами описательной статистики (пакеты “skimr” и “psych”), для расчета корреляционных связей между выборками применялся корреляционный анализ по Спирмену с построением коррелограммы. Для оценки значимости различий между группами применяли критерий Краскела — Уоллиса с последующим апостериорным тестом Данна на множественность сравнений. Различия считались статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты

Основные результаты исследования

При оценке содержания цитокинов в коже здоровых лиц и в очагах поражения и видимо непораженной коже больных грибовидным микозом значимые различия выявлены только для IL-4 и TNF-á (рис. 1).

Рис. 1. Содержание IL-4 и TNF-á в коже здоровых лиц (К) и в визуально неповрежденной (НК) и поврежденной коже (ПК) пациентов с ГМ

Fig. 1. The concentration of IL-4 and TNF-á in the skin of healthy individuals (K), visually unaffected skin (НК) and lesions (ПК) of patients with mycosis fungoides

Рис. 2. Коррелограмма взаимосвязей цитокинов в неповрежденной коже (показаны только значимые корреляции, р < 0,05)

Fig. 2. Correlogram of cytokine relationships in visually unaffected skin (only significant correlations are shown, p < 0.05)

Рис. 3. Коррелограмма взаимосвязей цитокинов в пораженной коже (показаны только значимые корреляции, р < 0,05)

Fig. 3. Correlogram of cytokine relationships in the lesions (only significant correlations are shown, p < 0.05)

При проведении корреляционного анализа в неповрежденной коже (рис. 2) выявлена взаимосвязь между уровнями IL-6 и IFN-ã (r = 0,92), IL-17A (r = 0,65), IL-17F (r = 0,68) и IL-25 (r = 0,5, рис. 2). Уровень IFN-ã был связан с IL-22 (r = 0,43), IL-17A (r = 0,66), IL-17F (r = 0,8), IL-25 (r = 0,69), IL-31 (r = 0,51). IL-22 — c IL-17A (r = 0,77), IL-17F (r = 0,64), IL-25 (r = 0,81), IL-31 (r = 0,83) и IL-1â (r = 0,63). IL-17A был связан с IL-25 (r = 0,79), IL-31 (r = 0,86), IL-1â (r = 0,8), IL-10 (r = 0,52). Уровень IL-17F был также связан с IL-25 (r = 0,86), IL-31 (r = 0,85), IL-1â (r = 0,42), IL-10 (r = 0,43) и IL-21 (r = 0,54). Il-25 — c IL-31 (r = 0,87), IL-1â (r = 0,55), IL-10 (r = 0,61). Уровни IL-31 — c IL-1â (r = 0,72), IL-10 (r = 0,52) и IL-21 (r = 0,46). IL-10 положительно коррелировал с IL-1â (r = 0,61), а IL-4 — c IL-33 (r = 0,47), sCD40L (r = 0,65) и TNF-á (r = 0,49). Была обнаружена связь уровня IL-33 c sCD40L (r = 0,77) и TNF-á (r = 0,62). Высокий уровень корреляции был выявлен между sCD40L и TNF-á (r = 0,89).

В пораженной коже (рис. 3) выявлено наличие положительной связи между уровнями IL-31 и IL-1â (r = 0,62). Уровень IL-31 был связан с уровнями TNF-á (r = 0,53), IL-17F (r = 0,63) и sCD40L (r = 0,63). IL-23 — с IL-21 (r = 0,4), IL-25 (r = 0,28), IL-10 (r = 0,69). IL-21 также коррелировал с IL-25 (r = 0,74), IL-10 (r = 0,35), IFN-ã (r = 0,36). IL-25 — c IL-10 (r = 0,51), IFN-ã (r = 0,48), IL-6 (r = 0,54), IL-17A (r = 0,59). IL-10 — c IFN-ã (r = 0,71). IL-22 коррелировал с IL-33 (r = 0,53), а TNF-á — с IL-33 (r = 0,46), IL-17F (r = 0,79), sCD40L (r = 0,82). IL-17F был положительно связан с sCD40L (r = 0,82), IL-4 (r = 0,43) и IL-17A (r = 0,5). IL-4 был связан с уровнями IL-6 (r = 0,7) и IL-17A (r = 0,7). Очень тесная корреляция была выявлена между IL-6 и IL-17A (r = 0,95).

Корреляционный анализ концентрации цитокинов в пораженной коже и индекса mSWAT не позволил выявить статистически значимых различий, за исключением существенной тенденции к отрицательной взаимосвязи — чем выше индекс mSWAT, тем меньше IFN-ã (р = 0,056); в неповрежденной коже статистически значимых различий выявлено не было. Важно отметить, что ни один из цитокинов в очагах поражения и визуально непораженной коже не был связан с индексом mSWAT.

Нежелательные явления

При проведении исследования нежелательных явлений отмечено не было.

Обсуждение

Продемонстрированное нами повышение содержания IL-4 в коже больных грибовидным микозом (ГМ) может свидетельствовать о значимой роли Th2, что, согласно литературным данным, в большей степени характеризует процессы, происходящие при прогрессировании заболевания в более поздние стадии [6]. Подавляющее действие IL-4 на экспрессию цитокинов Th1-типа (TNF-á, IL-2, IL-12 и IFN-ã), преобладающих на ранних стадиях, стимулирует пролиферацию злокачественных клеток [7]. В то же время нами выявлены различия для TNF-á в очагах поражения и видимо неповрежденной коже в сравнении с контрольной группой. Являясь центральным медиатором иммунных и воспалительных реакций, TNF-á может приводить к обострению заболевания у больных с пониженным уровнем экспрессии данного цитокина [8]. Доминирование на ранних стадиях Th1-клеток и повышенной экспрессии TNF-á, IL-2, IL-12 и IFN-ã может играть положительную роль в связи со способностью IFN-ã ингибировать пролиферацию опухолевых клеток, тем самым снижая темпы прогрессирования заболевания, для которого характерны преобладание Th2 и экспрессия IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, опосредованно ведущих к развитию иммуносупрессии и повышению чувствительности к бактериальным инфекциям [6].

Обнаруженные нами корреляционные взаимосвязи между уровнями цитокинов в коже больных грибовидным микозом свидетельствуют об участии в патологическом процессе Th1-цитокинов (TNF-á, IL-2, IL-12 и IFN-ã), Th2 (IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IL-25, IL-31, IL-33), Th17 (IL-17A, IL-17F, TNF-á, IL-6, IL-22) [9, 10], а также возможно и Th22-типа (IL-22, IL-10, TNF-á) [11, 12]. Полученные результаты согласуются с литературными данными о роли, помимо Th1 и Тh2, Тh17-клеток [13]. T. Krejsgaard и соавт. (2013 г.) отметили высокий уровень экспрессии IL-17F в очагах поражения больных ГМ [14]. Однако роль фенотипа Th17, и прежде всего IL-17, в патогенезе ГМ по-прежнему противоречива [15–17]. Известно, что продукция IL-22 связана с экспрессией IL-17A клетками фенотипа Th17, однако недавние исследования показали, что выработка IL-22 может происходить и при отсутствии IL-17A за счет экспрессии Th22-клетками [18, 19]. T. Miyagaki и соавт. (2011 г.) обнаружили, что уровень экспрессии IL-22, IL-10, IL-4 в очагах поражения больных Т-клеточными лимфомами кожи значительно превышал уровень экспрессии IL-17A, IL-17F, IL-23p19, что, по мнению авторов, свидетельствует о более значимой роли IL-22 в прогрессировании заболевания по сравнению с IL-17 [20].

Выявленная нами тенденция к отрицательной взаимосвязи между индексом mSWAT и IFN-ã согласуется с литературными данными о положительной роли IFN-ã в течении заболевания [6].

Ограничения исследования

У всех больных грибовидным микозом, включенных в наше исследование, установлены стадии IB—IIA, однако степень выраженности клинических проявлений при одной и той же стадии различалась от ограниченных высыпаний с низкими значениями индекса mSWAT до распространенных с высокими значениями mSWAT. Несмотря на то что индекс mSWAT позволяет оценить тяжесть кожного поражения у больных ГМ, он не включен в систему стадирования, применяемую согласно рекомендациям Международного общества по лимфомам кожи (ISLE) и Европейской организации по изучению и лечению рака (EORTC), что не позволяет в полной мере оценить выраженность клинических проявлений и прогрессирование процесса [21].

Заключение

Проведенное нами исследование не выявило взаимосвязи между индексом mSWAT и определяемыми цитокинами. В то же время обнаружено существенное изменение взаимоотношений цитокинов в патологически измененной коже по сравнению с видимо непораженной, с формированием специфической цитокиновой сети.

Об авторах