Skin cytokine profile in patients with mycosis fungoides

Full Text

Введение

Грибовидный микоз — наиболее часто встречающееся заболевание из группы первичных Т-клеточных лимфом кожи, характеризующихся неконтролируемой пролиферацией малых и средних атипичных Т-лимфоцитов с формированием доминирующего клона в коже и по мере прогрессирования заболевания в лимфатических узлах, крови и внутренних органах [1, 2].

Злокачественная пролиферация Т-лимфоцитов при ГМ сопровождается изменением цитокинового профиля в коже больных: часть цитокинов интенсивно синтезируется и стимулирует пролиферацию атипичных клеток, в то время как синтез цитокинов — ингибиторов опухолевого роста угнетается, что способствует прогрессированию заболевания [3].

Цель исследования: определить концентрации цитокинов в коже больных грибовидным микозом и оценить взаимосвязи с клинической картиной заболевания.

Методы

Дизайн исследования

Одномоментное исследование.

Критерии соответствия

В исследование включали пациентов старше 18 лет с установленным диагнозом Т-клеточной лимфомы кожи — грибовидный микоз на ранних стадиях (IA — IIA), не получающих в момент включения системной иммуномодулирующей и/или иммуносупрессивной терапии.

Условия проведения

Исследование проводилось на базе Федерального государственного бюджетного учреждения «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Продолжительность исследования

В статье представлены результаты исследования, полученные в период с 2018 по 2020 г.

Материал и методы

В исследование последовательно включен 21 больной грибовидным микозом на ранних стадиях (IВ—IIA) и 4 здоровых добровольца, которые подписали форму информированного согласия на участие в исследовании. Возраст пациентов варьировал от 28 до 74 лет (средний — 55,8 года). Средняя продолжительность заболевания составила 14,6 года. У 11 больных (52,3%) была диагностирована стадия IB, у 10 больных (47,7%) в связи с выявленным увеличением групп лимфатических узлов при проведении ультразвукового исследования — IIA стадия. У всех больных присутствовали пятнистые и инфильтративно-бляшечные элементы, у 8 больных помимо пятен и бляшек наблюдались очаги пойкилодермии. Оценка тяжести поражения кожных покровов проводилась с применением клинического индекса оценки площади поражения BSA и модифицированной шкалы mSWAT [4, 5]. Площадь поражения составляла от 8 до 64% (в среднем 26,4%), значение модифицированной шкалы оценки тяжести кожного поражения mSWAT варьировало от 11 до 105 и в среднем составляло 39,9 балла.

У всех пациентов получен биоматериал из наиболее инфильтрированного очага пораженной и участка визуально непораженной кожи.

Все полученные образцы взвешивались на лабораторных весах в промаркированных пробирках объемом 1,5 мл типа «Эппендорф» (Axygen), затем гомогенизировались с помощью автоматизированной системы для дезагрегации тканей Medimachine (Becton Dickinson, США) в специальных одноразовых камерах Medicons (Becton Dickinson, США) в течение 2 мин c добавлением 1 мл фосфатного буфера (рH = 7,4) к каждому образцу с последующей фильтрацией через одноразовый фильтр с размером пор 50 мкм с целью предотвращения засорения проточной системы прибора.

Определение концентрации цитокинов в образцах проводилось на приборе Bio-Plex 200 (Bio-Rad) c использованием коммерческого набора реагентов Bio-Plex Pro Human Th17 Cytokine Panel 15-Plex (Bio-Rad), позволяющего одновременно определить содержание следующих цитокинов: IL-1â, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, IL-17F,
IL-21, IL-22, IL-23, IL-25, IL-31, IL-33, IFN-ã, sCD40L, TNF-á. Исследование каждого образца проводилось в дублях по 50 мкл суспензии согласно протоколу производителя с использованием автоматической станции отмывки микропланшетов Bio-Plex ProWash Station (Bio-Rad), шейкера для микропланшетов (Biosan). Для калибровки прибора использовали набор Calibrationkit (Bio-Rad). Учет результатов проводился автоматически в приложении Bio-PlexManager (Bio-Rad) в размерности пг/мл. Полученные значения пересчитывали в соответствии с первоначальным весом биоптата и выражали в пг/мг.

Этическая экспертиза

Исследование проведено в соответствии с требованиями Декларации Хельсинки, протокол исследования одобрен локальным Этическим комитетом.

Статистический анализ

Принципы расчета размера выборки: размер выборки предварительно не рассчитывался.

Методы статистического анализа данных: анализ и визуализация полученных данных проведены с использованием R Statistical Software or MacOS (версия 1.3.1056), свободная среда разработки программного обеспечения с открытым исходным кодом для языка программирования R. Оценка распределения данных проводилась при помощи критерия Шапиро — Уилка. Данные представлены в виде медианы (25–75) методами описательной статистики (пакеты “skimr” и “psych”), для расчета корреляционных связей между выборками применялся корреляционный анализ по Спирмену с построением коррелограммы. Для оценки значимости различий между группами применяли критерий Краскела — Уоллиса с последующим апостериорным тестом Данна на множественность сравнений. Различия считались статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты

Основные результаты исследования

При оценке содержания цитокинов в коже здоровых лиц и в очагах поражения и видимо непораженной коже больных грибовидным микозом значимые различия выявлены только для IL-4 и TNF-á (рис. 1).

Рис. 1. Содержание IL-4 и TNF-á в коже здоровых лиц (К) и в визуально неповрежденной (НК) и поврежденной коже (ПК) пациентов с ГМ

Fig. 1. The concentration of IL-4 and TNF-á in the skin of healthy individuals (K), visually unaffected skin (НК) and lesions (ПК) of patients with mycosis fungoides

Рис. 2. Коррелограмма взаимосвязей цитокинов в неповрежденной коже (показаны только значимые корреляции, р < 0,05)

Fig. 2. Correlogram of cytokine relationships in visually unaffected skin (only significant correlations are shown, p < 0.05)

Рис. 3. Коррелограмма взаимосвязей цитокинов в пораженной коже (показаны только значимые корреляции, р < 0,05)

Fig. 3. Correlogram of cytokine relationships in the lesions (only significant correlations are shown, p < 0.05)

При проведении корреляционного анализа в неповрежденной коже (рис. 2) выявлена взаимосвязь между уровнями IL-6 и IFN-ã (r = 0,92), IL-17A (r = 0,65), IL-17F (r = 0,68) и IL-25 (r = 0,5, рис. 2). Уровень IFN-ã был связан с IL-22 (r = 0,43), IL-17A (r = 0,66), IL-17F (r = 0,8), IL-25 (r = 0,69), IL-31 (r = 0,51). IL-22 — c IL-17A (r = 0,77), IL-17F (r = 0,64), IL-25 (r = 0,81), IL-31 (r = 0,83) и IL-1â (r = 0,63). IL-17A был связан с IL-25 (r = 0,79), IL-31 (r = 0,86), IL-1â (r = 0,8), IL-10 (r = 0,52). Уровень IL-17F был также связан с IL-25 (r = 0,86), IL-31 (r = 0,85), IL-1â (r = 0,42), IL-10 (r = 0,43) и IL-21 (r = 0,54). Il-25 — c IL-31 (r = 0,87), IL-1â (r = 0,55), IL-10 (r = 0,61). Уровни IL-31 — c IL-1â (r = 0,72), IL-10 (r = 0,52) и IL-21 (r = 0,46). IL-10 положительно коррелировал с IL-1â (r = 0,61), а IL-4 — c IL-33 (r = 0,47), sCD40L (r = 0,65) и TNF-á (r = 0,49). Была обнаружена связь уровня IL-33 c sCD40L (r = 0,77) и TNF-á (r = 0,62). Высокий уровень корреляции был выявлен между sCD40L и TNF-á (r = 0,89).

В пораженной коже (рис. 3) выявлено наличие положительной связи между уровнями IL-31 и IL-1â (r = 0,62). Уровень IL-31 был связан с уровнями TNF-á (r = 0,53), IL-17F (r = 0,63) и sCD40L (r = 0,63). IL-23 — с IL-21 (r = 0,4), IL-25 (r = 0,28), IL-10 (r = 0,69). IL-21 также коррелировал с IL-25 (r = 0,74), IL-10 (r = 0,35), IFN-ã (r = 0,36). IL-25 — c IL-10 (r = 0,51), IFN-ã (r = 0,48), IL-6 (r = 0,54), IL-17A (r = 0,59). IL-10 — c IFN-ã (r = 0,71). IL-22 коррелировал с IL-33 (r = 0,53), а TNF-á — с IL-33 (r = 0,46), IL-17F (r = 0,79), sCD40L (r = 0,82). IL-17F был положительно связан с sCD40L (r = 0,82), IL-4 (r = 0,43) и IL-17A (r = 0,5). IL-4 был связан с уровнями IL-6 (r = 0,7) и IL-17A (r = 0,7). Очень тесная корреляция была выявлена между IL-6 и IL-17A (r = 0,95).

Корреляционный анализ концентрации цитокинов в пораженной коже и индекса mSWAT не позволил выявить статистически значимых различий, за исключением существенной тенденции к отрицательной взаимосвязи — чем выше индекс mSWAT, тем меньше IFN-ã (р = 0,056); в неповрежденной коже статистически значимых различий выявлено не было. Важно отметить, что ни один из цитокинов в очагах поражения и визуально непораженной коже не был связан с индексом mSWAT.

Нежелательные явления

При проведении исследования нежелательных явлений отмечено не было.

Обсуждение

Продемонстрированное нами повышение содержания IL-4 в коже больных грибовидным микозом (ГМ) может свидетельствовать о значимой роли Th2, что, согласно литературным данным, в большей степени характеризует процессы, происходящие при прогрессировании заболевания в более поздние стадии [6]. Подавляющее действие IL-4 на экспрессию цитокинов Th1-типа (TNF-á, IL-2, IL-12 и IFN-ã), преобладающих на ранних стадиях, стимулирует пролиферацию злокачественных клеток [7]. В то же время нами выявлены различия для TNF-á в очагах поражения и видимо неповрежденной коже в сравнении с контрольной группой. Являясь центральным медиатором иммунных и воспалительных реакций, TNF-á может приводить к обострению заболевания у больных с пониженным уровнем экспрессии данного цитокина [8]. Доминирование на ранних стадиях Th1-клеток и повышенной экспрессии TNF-á, IL-2, IL-12 и IFN-ã может играть положительную роль в связи со способностью IFN-ã ингибировать пролиферацию опухолевых клеток, тем самым снижая темпы прогрессирования заболевания, для которого характерны преобладание Th2 и экспрессия IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, опосредованно ведущих к развитию иммуносупрессии и повышению чувствительности к бактериальным инфекциям [6].

Обнаруженные нами корреляционные взаимосвязи между уровнями цитокинов в коже больных грибовидным микозом свидетельствуют об участии в патологическом процессе Th1-цитокинов (TNF-á, IL-2, IL-12 и IFN-ã), Th2 (IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IL-25, IL-31, IL-33), Th17 (IL-17A, IL-17F, TNF-á, IL-6, IL-22) [9, 10], а также возможно и Th22-типа (IL-22, IL-10, TNF-á) [11, 12]. Полученные результаты согласуются с литературными данными о роли, помимо Th1 и Тh2, Тh17-клеток [13]. T. Krejsgaard и соавт. (2013 г.) отметили высокий уровень экспрессии IL-17F в очагах поражения больных ГМ [14]. Однако роль фенотипа Th17, и прежде всего IL-17, в патогенезе ГМ по-прежнему противоречива [15–17]. Известно, что продукция IL-22 связана с экспрессией IL-17A клетками фенотипа Th17, однако недавние исследования показали, что выработка IL-22 может происходить и при отсутствии IL-17A за счет экспрессии Th22-клетками [18, 19]. T. Miyagaki и соавт. (2011 г.) обнаружили, что уровень экспрессии IL-22, IL-10, IL-4 в очагах поражения больных Т-клеточными лимфомами кожи значительно превышал уровень экспрессии IL-17A, IL-17F, IL-23p19, что, по мнению авторов, свидетельствует о более значимой роли IL-22 в прогрессировании заболевания по сравнению с IL-17 [20].

Выявленная нами тенденция к отрицательной взаимосвязи между индексом mSWAT и IFN-ã согласуется с литературными данными о положительной роли IFN-ã в течении заболевания [6].

Ограничения исследования

У всех больных грибовидным микозом, включенных в наше исследование, установлены стадии IB—IIA, однако степень выраженности клинических проявлений при одной и той же стадии различалась от ограниченных высыпаний с низкими значениями индекса mSWAT до распространенных с высокими значениями mSWAT. Несмотря на то что индекс mSWAT позволяет оценить тяжесть кожного поражения у больных ГМ, он не включен в систему стадирования, применяемую согласно рекомендациям Международного общества по лимфомам кожи (ISLE) и Европейской организации по изучению и лечению рака (EORTC), что не позволяет в полной мере оценить выраженность клинических проявлений и прогрессирование процесса [21].

Заключение

Проведенное нами исследование не выявило взаимосвязи между индексом mSWAT и определяемыми цитокинами. В то же время обнаружено существенное изменение взаимоотношений цитокинов в патологически измененной коже по сравнению с видимо непораженной, с формированием специфической цитокиновой сети.

About the authors

Arfenya E. Karamova

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology, Ministry of Health of the Russian Federation

Author for correspondence.
Email: karamova@cnikvi.ru
ORCID iD: 0000-0003-3805-8489
SPIN-code: 3604-6491

MD, Cand. Sci. (Med.)

Россия, Korolenko str., 3, bldg 6, Moscow, 107076, Russia

Alexandr А. Nikonorov

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology, Ministry of Health of the Russian Federation

Email: nikonorov_all@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7214-8176
SPIN-code: 3859-7081

MD, Dr. Sci. (Med.), Professor

Россия, Korolenko str., 3, bldg 6, Moscow, 107076, Russia

Dmitry A. Verbenko

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology, Ministry of Health of the Russian Federation

Email: verbenko@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-1104-7694
SPIN-code: 8261-6561

Cand. Sci. (Biol.)

Россия, Korolenko str., 3, bldg 6, Moscow, 107076, Russia

Lyudmila F. Znamenskaya

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology, Ministry of Health of the Russian Federation

Email: znaml@cnikvi.ru
ORCID iD: 0000-0002-2553-0484
SPIN-code: 9552-7850

MD, Dr. Sci. (Med.)

Россия, Korolenko str., 3, bldg 6, Moscow, 107076, Russia

Anastasiia Vorontsova

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology, Ministry of Health of the Russian Federation

Email: vorontsova@cnikvi.ru
ORCID iD: 0000-0002-3129-0050
SPIN-code: 8334-2890

junior research associate

Россия, Korolenko str., 3, bldg 6, Moscow, 107076, Russia

References

Supplementary files