Association of polymorphisms in TNFAIP3 and TNIPI genes with predisposition to the development of psoriasis in the Russian population

Full Text

Псориаз является одним из наиболее распространенных дерматозов; в мире этим заболеванием страдают 120—180 млн человек [1]. Псориаз относится к мультифакторным генетическим заболеваниям и в базе данных наследственных заболеваний (Online Mendelian Inheritance in Man) зарегистрирован под номером OMIM 177900. Риск возникновения мультифакторного генетического заболевания, как правило, обусловлен мутациями/полиморфизмами в нескольких генах. Первые генетические исследования ассоциаций генетических локусов с псориазом были проведены в 70-х годах XX века. Регион размером 80—200 кб, содержащий ген HLA-C, был первым выявленным локусом, ассоциированным с псориазом, и получил название PSORS1. В 1999 г. были выявлены еще два гена в геномном локусе PSORS: ген CDSN и CCHCR1 [2—5]. Последние данные свидетельствуют о том, что, скорее всего, основной генетической детерминантой предрасположенности к псориазу является HLA-Cw6-аллель локу-са PSORS1 [6—8]. Развитие генетики и постгеномных технологий позволило изучить в геноме человека сотни тысяч однонуклеотидных полиморфизмов (singlenucleotide polymorphism — SNP) и способствовало развитию популяционных исследований с применением методологии полногеномного скрининга ассоциаций. В последние годы активно изучаются ассоциации предрасположенности к развитию псориаза с мутациями/полиморфизмами в генах: отвечающих за нарушение барьерной функции кожи (LCE3E, LCE3C, LCE3D); участвующих в сигнальном пути интерлейкина-23 (IL-23A, IL-23R, IL-13 и IL-12B); в сигнальном пути фактора транскрипции NF-кВ (NFkBİA, REL, TYK2, IFIH1, IL-28RA, TNIP1 и TNFAIP3), в синтезе цитокина интерлейкин-17 (TRAF3IP2, TYK2 и IL-23R); в презентации антигена (гены региона HLA-C, ERAP1 и др.) [9]. Центральную роль во многих клеточных процессах, в том числе в процессах пролиферации и дифференцировки кератиноцитов, играет сигнальный путь ядерного фактора NF-кВ. Нарушения, ведущие к чрезмерной активации транскрипционного фактора NF-кВ, способствуют развитию иммунозависимых заболеваний, в частности псориаза и псо-риатического артрита [10]. Установлена ассоциация с развитием псориаза полиморфизмов генов, кодирующих такие белки этого пути, как А20 (TNFAIP3), и взаимодействующий с ним индуцированный фактором некроза опухоли-α (ФНО-α) белок ABIN-1 (TNIP1) [11]. Ген TNFAIP3 кодирует белок А20. Своими фрагментами (ZF7) он связывается со специфическими NF-kB сигнальными белками через убиквитин, нарушая прохождение сигнала, который может привести к развитию «воспалительных заболеваний», в том числе псориаза [12, 13]. Таким образом, белок A20 снижает активность транскрипционного фактора NF-кВ. Ген TNIP1 кодирует белок ABIN-1, связывающийся с белком А20 и играющий важную роль в аутоиммунном и тканевом гомеостазе, путем регуляции ядерного фактора транскрипции NF-кВ [14]. Мутации в этом гене ассоциируются с предрасположенностью к развитию псориатического артрита, ревматоидного артрита и системной красной волчанки. ABIN-1 присутствует в моноцитах периферической крови, селезенке, скелетных мышцах, а также в почках. Экспрессия TNIP1 индуцируется фактором транскрипции NF-кВ; повышенная экспрессия TNIP1 ингибирует NF-кВ посредством ФНО-α [15]. Белок АВ^-1, кроме того, обладает способностью ингибировать апоптоз, индуцированный ФНО-α. Показано, что АВ^-1-дефицитные мыши умирают в процессе эмбриогенеза из-за ФНО-α-зависимого апоптоза гепатоцитов [16]. Таким образом, АВ^-1 совместно с А20 регулирует активность NF-кВ, а также предотвращает развитие апоптоза, индуцированного ФНО-α. В работах R. Nair и соавт. (2009) и J. Gudjonsson и соавт. (2009), изучавших ассоциации между полиморфизмами генов TNFAIP3 и TNIPI и предрасположенностью к развитию псориаза, выявлены значимые различия в частоте встречаемости полиморфизмов генов TNFAIP3 (rs610604) и TNIPI (rs17728338) между группой больных псориазом и контрольной группой здоровых лиц. Таким образом, выявлено, что генетические изменения в данных генах могут быть ассоциированы с развитием псориаза [17, 18]. Изучение полиморфизмов генов TNFAIP3 и TNIPI в российской популяции до настоящего времени не проводилось. Целью настоящего исследования явилось изучение частоты встречаемости полиморфизмов генов TNFAIP3 (rs610604) и TNIPI (rs17728338) в выборке больных псориазом и здоровых добровольцев из Российской Федерации. Материал и методы В исследовании участвовали 376 лиц российской популяции (195 мужчин, 181 женщина) в воз Вестник дерматологии и венерологии Научные исследования л 51 расте от 18 до 77 лет, представителей европеоидной расы1. Среди обследованных было 287 больных (182 мужчины, 105 женщин) в возрасте от 18 до 77 лет с разными формами псориаза. значительная часть больных псориазом были жителями Нижегородской — 85 (29,6%) человек, Московской — 29 (10,1%) и Новосибирской — 40 (13,9%) областей Российской федерации; остальные пациенты были представителями других субъектов Российской федерации (Центральный регион: Воронежская, Калужская, Владимирская, Ярославская, Белгородская, Оренбургская, Ивановская области; поволжье: Республика Татарстан; Северо-западный регион: Калининградская область; Урал и Сибирь: Алтайский край, Свердловская, Иркутская области, Республика Тыва, Красноярский край; Юг России и Северный Кавказ: Ростовская область, республики чечня и Дагестан). Критериями включения являлись наличие у пациента диагноза псориаза по данным медицинского анамнеза (в течение не менее 12 мес.) с подтверждением диагноза при физикальном осмотре, проведенном исследователем; европеоидная раса; возраст пациента не менее 18 лет. Критериями исключения являлись: возраст менее 18 лет; отсутствие у пациента диагноза псориаза (даже при наличии диагноза псориатического артрита); нежелание или отсутствие возможности подписать информированное согласие. Тяжесть заболевания оценивалась по площади поражения кожи: легкая степень заболевания (< 10%) диагностирована у 58 (20%) пациентов, средняя и тяжелая (> 10%) — у 188 (65,5%) пациентов. Состояние 41 пациента оценить не удалось — часть биообразцов крови, полученных из регионов, не сопровождалась требуемыми данными. Вульгарный псориаз был диагностирован у 260 пациентов, псориатическая эритродермия — у 16, пустулезный псориаз — у 11; псориатический артрит наблюдался у 81, ладонно-подошвенный псориаз — у 15, явления экссудации отмечались у 10, псориатическое поражение ногтей — у 97. У 215 (75%) больных заболевание началось до 40 лет (I тип псориаза), у 52 (18%) — в возрасте 40 лет или позже (II тип псориаза), по 20 пациентам данные отсутствуют. Группу контроля составили 89 здоровых лиц. Материалом для проведения исследований явились образцы цельной крови, полученные от больных 1 Европеоидная раса (евразийская раса) — одна из основных больших рас человечества. Для представителей расы характерны светлая кожа, мягкие и волнистые волосы головы, сильный и средний рост волос на лице и теле (у мужчин), узкий и резко выступающий нос, тонкие губы, ортогнатизм. Область распространения — Европа, Северная Африка, Передняя Азия, Северная Индия; с европейской колонизацией европеоидная раса распространилась в Америке, Австралии и Южной Африке (Большой энциклопедический словарь). псориазом (n = 287) и здоровых добровольцев (n = 89); в качестве источника ДНК использовались лейкоциты периферической крови. Образцы крови получали с помощью вакуумных систем для забора крови типа Vacuette (BD Vacutainer, Великобритания) объемом 4 мл. До исследования образцы крови хранились в замороженном состоянии при -20 оС. Исследование проводили в несколько этапов: ■ выделение из образца крови геномной ДНК и оценка ее качества; ■ амплификация фрагментов генов TNFAIP3 и TNIPI и аллельспецифическая гибридизация амплифици-рованных фрагментов генов с соответствующими зондами в формате пЦР в реальном времени; ■ анализ полученных данных. Выделение ДНК из образцов крови проводили с использованием коммерческого набора реагентов Diatom™ DNA Prep 100 (Biokom, Россия) в соответствии с инструкциями производителя. Раствор ДНК объемом 100 мкл хранили в микропробирках типа Eppendorf при -20 °С. С помощью программы Oligo6 были подобраны праймеры для амплификации фрагментов генов TNFAIP3 и TNIPI, включающих изучаемые полиморфизмы, а также специфичные зонды, позволяющие идентифицировать соответствующие аллели генов TNFAIP3 и TNIPI (табл. 1). Амплификация каждого фрагмента проводилась с использованием набора с HS Taq ДНК-полимеразой (Евроген, Россия) в соответствии с инструкцией производителя с добавлением праймеров по 20 пмоль каждого, зондов по 10 пмоль и 200 нг ДНК человека, в формате 96-луночного планшета. пЦР фрагментов генов проводилась в режиме реального времени при следующих условиях: 95 °С — 7 мин., 40 циклов: 95 °С — 10 с., 56 °С — 1 мин., 72 °С — 1 с. Идентификация полиморфизмов генов проводилась путем ал-лельспецифической гибридизации амплифицирован-ных фрагментов генов с соответствующими зондами. Считывание сигналов флюоресценции с каналов детекции FAM и cy5 осуществлялось на стадии отжига праймеров (56 °С). Результаты исследований оценивались путем статистической обработки: частота встречаемости аллелей генов TNFAIP3 и TNIPI определялась путем прямого расчета. попарное сравнение частот генотипов в группах больных и здоровых лиц осуществляли с использованием двустороннего критерия χ2 для таблиц сопряженности 2 х 2. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05. Силу ассоциаций оценивали в значениях показателя отношения шансов оdds ratio (OR), рассчитываемого при помощи калькулятора, находящегося в открытом доступе на сайте библиотеки Meta Numerics (http://www.meta-numerics.net/Samples/ contingencycalculator.aspx). 52 к № 6, 2013 I ТабЛи а 1 Праймеры и зонды для осуществления амплификации фрагментов генов TNFAIP3 и TNIPI I ц и аллельспецифической гибридизации мишеней в формате ПЦР в реальном времени Ген Однонуклеотидные полиморфизмы (rs) Праймеры (для амплификации фрагмента гена) Зонды (для идентификации полиморфизма гена) TNFAIP3 rs610604 610604forGGATGGACCAAGATTGATTA 610604revCATCATTAGCTCATAGAACAA 610604G FAM-GAAAAGTGTGAGCTCTTCATC-BHQ1 610604T Cy5-GAAAAGT GTTAGCT CTT CAT C-BHQ2 TNIP1 rs17728338 17728338for T CATTAAGT GTAAACTGCAT 17728338rev CTATGCTCTGAGGACAAAT 17728338 FAM-TTAGTAGGACCGTTGCAAAAG-BHQ1 17728338 Cy5-TTAGTAGGACCATTGCAAAAG-BHQ2 Результаты и обсуждение В результате изучения полиморфизмов генов TNFAIP3 (rs610604) и TNIPI (rs17728338) были получены данные о распределении частот генотипов этих полиморфизмов в исследованной выборке пациентов и контрольной группе. В каждой изученной позиции генов выявлено распределение трех вариантов генотипа (два гомозиготных и один гетерозиготный; табл. 2). Ген TNFAIP3 (rs610604). Генотип А/С полиморфизма rs610604, встречавшийся в общей выборке обследованных в 48,4% случаев, с большей частотой регистрировался у больных псориазом (51,9%), чем у здоровых (37,0%). Различия в частоте выявления данного генотипа между группами больных псориазом и здоровыми оказались статистически достоверными (OR = 1,8; χ2 = 5,9; р < 0,05), что позволяет рассматривать носителей данного генотипа как лиц с повышенной предрасположенностью к развитию псориаза, а сам генотип А/С — как предиктор развития псориаза в российской популяции. Напротив, частота регистрации гомозиготного генотипа А/А, который в общей выборке обследованных регистрировался у 43,0%, у больных псориазом составила 39,4% и была ниже, чем у здоровых, — 55,1%. Различия в частоте выявления данного генотипа полиморфизма rs610604 между группами больных псориазом и здоровыми оказались статистически достоверными (OR = 0,6; χ2 = 4,9; р < 0,05), что позволяет рас сматривать генотип А/А как протектор в отношении развития псориаза. Генотип С/С полиморфизма rs610604 был наиболее редким в обследованной выборке пациентов, встречался всего у 8,2% обследованных, в том числе у 8,7% больных псориазом и у 7,9% здоровых лиц. Достоверных различий в частоте данного генотипа между группами обследуемых не установлено. Ген TNIP1 (rs17728338). В исследованной выборке генотип G/G полиморфизма rs17728338 встречался наиболее часто — у 79,6% обследованных: у 76,3% больных псориазом, у 89,9% здоровых лиц. Достоверных различий в частоте встречаемости данного генотипа между группами обследуемых не установлено. Генотип А/G полиморфизма rs17728338 встречался реже — у 19,6% обследованных: у 22,6% больных псориазом, у 10,1% здоровых (в 2 раза реже, чем у больных псориазом). Различия в частоте выявления данного генотипа между группой больных псориазом и группой здоровых добровольцев оказались статистически достоверными (OR = 2,6; χ2 = 6,7; р < 0,01), что позволяет рассматривать носителей данного генотипа как лиц с предрасположенностью к развитию псориаза, а сам генотип А/G — как предиктор развития псориаза в российской популяции. Генотип А/А полиморфизма rs17728338 был наиболее редким в популяции (общая частота в выборке — 0,8%) и регистрировался только у больных псориазом с частотой 1,1%. Анализ частоты встречаемости ге I Таблица 2 Частота встречаемости различных генотипов SNP генов TNFAIP3 и TNIP у больных псориазом и здоровых добровольцев Группа обследованных TNFAIP3(rs610604) TNIP1(rs17728338) А/А С/С А/С G/G A/G A/A Больные псориазом 113/287 25/287 149/287 213/279 63/279 3/279 39,4% 8,7% 51,9% 76,3% 22,6% 1,1% Контрольная группа 49/89 7/89 33/89 80/89 9/89 0 55,1% 7,9% 37,0% 89,9% 10,1% Достоверность отличий p < 0,05 p > 0,05 p < 0,05 p > 0,05 p < 0,01 ,6 0, I I CC О OR = 1,8 ,8 2, I I R O χ2 I I 4, 9 χ2 = 5,9 χ2 I I 7, 6 Вестник дерматологии и венерологии Научные исследования л 53 нотипов, несущих аллель А (A/G и A/A), показал, что эти генотипы достоверно чаще встречались в группе больных псориазом по сравнению с контрольной группой (OR = 2,8; χ2 = 7,6; р < 0,01), что позволяет рассматривать носителей генотипов, несущих аллель А (A/G и A/A) полиморфизма rs17728338, как лиц с предрасположенностью к развитию псориаза, а генотипы A/G и A/A этого полиморфизма — как предикторы развития псориаза в российской популяции. Заключение В результате настоящего исследования были впервые установлены и проанализированы особенности распределения вариантов полиморфизмов генов TNFAIP3 frs610604) и TNIPI (rs17728338) в выборке больных псориазом и здоровых добровольцев из Российской федерации. Выявленное у больных псориазом достоверное преобладание частоты регистрации гетерозиготного генотипа A/c полиморфизма rs610604 гена TNFAIP3, а также генотипов полиморфизма rs17728338 гена TNIP1, несущих аллель А (A/G и A/A), по сравнению с контрольной группой позволяет рассматривать носителей данных генотипов как лиц с предрасположенностью к развитию псориаза, а генотипы A/c полиморфизма rs610604, A/G и A/A полиморфизма rs17728338 — как предикторы развития псориаза в российской популяции. Напротив, низкая частота встречаемости гомозиготного генотипа A/A полиморфизма rs610604 гена TNFAIP3 у больных псориазом указывает на отсутствие предрасположенности к псориазу у носителей данного генотипа. В связи с этим генотип A/A этого полиморфизма можно рассматривать как протектор в отношении развития псориаза в российской популяции. полученные данные расширяют представления о генетических факторах, ассоциированных с развитием псориаза, у лиц из российской популяции.

About the authors

A A KUBANOV

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology, Ministry of Healthcare of the Russian Federation

O S KOZHUSHNAYA

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology, Ministry of Healthcare of the Russian Federation

N V FRIGO

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology, Ministry of Healthcare of the Russian Federation

A A MINEYEVA

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology, Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: mineeva@cnikvi.ru

L F ZNAMENSKAYA

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology, Ministry of Healthcare of the Russian Federation

V V CHIKIN

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology, Ministry of Healthcare of the Russian Federation

References

Supplementary files