Studying of the expression of PERP protein in the skin of patients with pemphigus

Full Text

Истинная акантолитическая пузырчатка (ИАП) — аутоиммунный буллезный дерматоз, характеризующийся появлением пузырей на видимо непораженной коже и слизистых оболочках, быстро вскрывающихся и образующих эрозии. Гистологическим признаком заболевания является формирование интраэпидер-мальных полостей в результате акантолиза. ИАП сопровождается появлением циркулирующих и связанных в эпидермисе антител класса IgG к структурным белкам клеточной мембраны кератиноцитов [1]. ИАП развивается преимущественно в молодом и трудоспособном возрасте и отличается тяжелым течением с угрозой жизни больного [2, 3]. Внедрение глюкокортикостероидов в терапию данного заболевания позволило снизить показатели смертности с 90 до 10% [4, 5], и в настоящее время эта группа препаратов является базисной терапией ИАП [6]. Однако уже в течение первых лет применения иммуносупрессив-ная терапия влечет за собой тяжелые осложнения, которые могут явиться причиной летального исхода [2, 7, 8]. Актуальными являются исследования патогенеза ИАП, направленные на обнаружение новых потенциальных мишеней для терапевтического воздействия, которое позволило бы снизить дозу глюкокортикостероидов, уменьшить количество побочных эффектов и улучшить качество жизни больного [9]. Одним из перспективных направлений исследований патогенеза ИАП является изучение механизмов акантолиза с целью создания препаратов, блокирующих его развитие. Существует теория, согласно которой аутоантитела к белкам адгезии (десмоглеинам 1 и 3) блокируют их адгезивную функцию, что обусловливает потерю связи между кератиноцитами и развитие акантолиза [1]. Однако эта теория не объясняет, почему при микроскопическом исследовании эпидермиса больных истинной акантолитической пузырчаткой разрушению десмосом предшествует уменьшение объема кератиноцитов. В исследованиях [11—14] была продемонстрирована активация сигнальных и эффекторных белков апоптоза1 под действием IgG, полученных от больных вульгарной пузырчаткой. Полученные данные 1 Апоптоз (др.-греч. άπόπτωσις — опадание листьев) — программируемая клеточная смерть, регулируемый процесс самоликвидации на клеточном уровне, в результате которого клетка фрагментируется на отдельные апоптотические тельца, ограниченные плазматической мембраной. В процессе апоптоза выделяют три фазы: сигнальную, эффекторную и деградационную. В сигнальную фазу сигнал апоптоза передается в цитоплазму клетки посредством либо рецепторов гибели клетки, экспрессируемых на мембране клетки, либо выхода апоптогенных белков из межмембранного пространства митохондрий в цитоплазму клетки. В эффектор-ную фазу происходит активация каскада белков-эффекторов и регулирующих их белков-модуляторов. Основными эффекторами апоптоза являются каспазы — протеазы, разрушающие белковые структуры клетки. В фазу деградации клетка фрагментируется на отдельные апоптотические тельца, ограниченные плазматической мембраной. Фрагменты погибшей клетки обычно очень быстро фагоцитируются макрофагами либо соседними клетками, минуя развитие воспалительной реакции [10]. позволили сформулировать концепцию апоптолиза, по-новому объясняющую патоморфологические изменения в коже при ИАП [15]. Согласно этой концепции присоединение антител к десмоглеинам и другим белкам поверхности кератиноцитов, расположенным на мембране клеток, инициирует передачу сигналов внутрь клетки, активирующих апоптоти-ческие ферменты цитоплазмы (каспазу 3 [16], ка-спазу 8 [12], каспазу 9 [17]). Каспазы представляют собой цистеиновые протеазы, которые расщепляют аминокислотные последовательности после остатка аспарагиновой кислоты [18]. Одной из основных функций эффекторных каспаз является прямое и опосредованное разрушение клеточных структур: гидролизу подвергаются белки ядерной мембраны, цитоскелета, расщепляются белки, регулирующие клеточную адгезию. Таким образом, вследствие ретракции тонофиламентов, деградации структурных белков, включая десмоглеины, под действием ка-спаз уменьшается объем кератиноцитов с последующим механическим разрывом десмосом и формированием межклеточных щелей [12, 13, 15]. Концепцию апоптолиза также поддерживают результаты экспериментов X. Wang и соавт. (2004), продемонстрировавших способность ингибиторов каспаз блокировать акантолиз, вызванный IgG, полученными от больных вульгарной пузырчаткой [19, 20]. Белок PERP (от англ. p53 apoptosis effector related to PMP-22 — апоптотический эффектор белка р53, относящийся к периферическим миелиновым белкам-22) — трансмембранный полипептид с молекулярной массой 21,4 кД, впервые был описан в 2000 г. L. Attardi и соавт. [21], которые продемонстрировали, что экспрессия гена PERP регулируется супрессором опухолей р53, а повышение экспрессии белка PERP приводит к гибели фибробластов. В 2005 г. R. Ihrie и соавт. обнаружили, что ген PERP также регулируется геном р63, который в свою очередь является основным регулятором созревания клеток многослойного плоского эпителия [22]. Эксперименты, проведенные авторами, показали, что PERPv- мыши (нокаутные мыши, у которых выключен ген PERP) вскоре после рождения погибали в результате образования обширных внутриэпидермальных пузырей и эрозий на коже и слизистых оболочках. Установлено, что в кератино-цитах этих мышей десмосомы образуются, но их количество снижено, также нарушена связь между белками десмосом и прикрепление десмосом к цитоскелету [23]. На основании полученных результатов авторы делают выводы о том, что белок PERP необходим для реализации адгезивной функции десмосом. Таким образом, белок PERP участвует в реализации апоптоза, регулирует пролиферацию кератиноцитов и обеспечивает межклеточную адгезию. Исследование экспрессии белка PERP в коже больных ИАП не проводилось. 62 L № 6, 2013 Цель исследования: изучить экспрессию белка PERP в коже больных ИАп. Материал и методы Обследованы 22 больных ИАп: 10 (45,5%) мужчин, 12 (54,5%) женщин в возрасте от 18 до 76 лет (средний возраст 54,22 ± 17,6 года). У 17 (77,3%) больных установлен диагноз вульгарной пузырчатки, у 4 (18,2%) — себорейной пузырчатки, у 1 (4,5%) — листовидной формы ИАп. Возраст больных при дебюте ИАп варьировал от 17 до 75 лет (средний возраст 51,9 ± 17,3 года). Длительность заболевания составляла от 1 мес. до 9,5 года (в среднем 23,5 мес). положительный симптом Никольского наблюдался у 20 (90,9%) больных, при цитологическом исследовании акантолитические клетки обнаружены у всех (100%) больных. пациенты получали терапию преднизолоном в дозе 1 мг на 1 кг массы тела, а также сопутствующую терапию по показаниям (ингибиторы протонного насоса, препараты калия, кальция, анаболические гормоны, антигипер-тензивные препараты и др.). У большинства больных — у 13 (59,1%) патологический процесс локализовался на коже с одновременным вовлечением слизистых оболочек. У 2 (9,1%) пациентов отмечалось поражение только слизистой оболочки полости рта (рис. 1) без клинических проявлений на коже, у 4 (18,2%) было выявлено поражение только кожных покровов. площадь поражения кожных покровов у больных истинной пузырчаткой составляла от 1 до 18% (в среднем 6,24%). Группу сравнения составили 10 здоровых добровольцев: 6 (60%) женщин и 4 (40%) мужчин в возрасте от 20 до 60 лет. Также был обследован пациент (возраст 64 года) с буллезным пемфигоидом Левера, с распространенными высыпаниями, локализующимися на коже туловища, верхних и нижних конечностей, представленными единичными пузырями диаметром до 1,5 см в диаметре с прозрачным содержимым, эрозиями до 2 см в диаметре с венчиком гиперемии по периферии и очагами эритемы розового цвета с коричневатым оттенком на коже туловища, верхних и нижних конечностей. Диагноз ИАп устанавливался на основании данных клинической картины, результатов цитологического и гистологического исследований, реакции непрямой иммунофлюоресценции с антителами к IgG. Забор биоптатов проводился под местной анестезией 2% раствором лидокаина. Биопсировали пузырные элементы и участки видимо непораженной кожи. Для подтверждения диагноза ИАп биоптаты с пузырными элементами подвергали стандартной гистологической обработке: фиксировали в 10% растворе забуференного формалина, подвергали гистологической проводке путем обезвоживания в изопропиловом Рис. 1. Поражение кожи и красной каймы губ у больной вульгарной пузырчаткой спирте и заливки в парафин. парафиновые срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Для определения фиксации IgG и изучения экспрессии белка PERP биоптаты с участков видимо непораженной кожи и 3 биоптата с пузырными элементами (от больных ИАп и от больного буллезным пем-фигоидом Левера) помещали в салфетку, смоченную физиологическим раствором, сразу после получения доставляли в патоморфологическую лабораторию, где биоптаты заливали в среду для замораживания Tissue-Tek (Sakura, Netherlands) и помещали в морозильную камеру при температуре -30 °С. Из блоков на криостатном микротоме Slee изготавливали срезы толщиной 5—6 мкм. Срезы растягивали на предметных стеклах с полилизиновым покрытием Vision biosystems plus slides (Великобритания), высушивали при температуре 25 °С в течение 30 мин. постановку реакции иммунофлюоресценции проводили согласно инструкции к антителам. после высыхания срезы фиксировали в ацетоне в течение 2 мин., промывали в растворе фосфатного буфера (PBS-tween, рН 7,4 ± 1,0) трижды по 5 мин. Для предотвращения эндогенной пероксидазной активности на срезы наносили 5% раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА-tween), инкубировали при 25 °С в течение 60 мин. затем, не смывая БСА, на срезы наносили антитела к IgG и к белку PERP в рабочем разведении 1:300, инкубировали при 25 °С в течение 60 мин., по истечении которых срезы промывали в растворе фосфатного буфера (PBS-tween, рН 7,4 ± 1,0) трижды по 5 мин. после промывания на срезы наносили вторичные антитела, меченные флуорохромом, инкубировали при 25 °С в течение 60 мин. Вторичные антитела отмывали также раствором фосфатного буфера (PBS-tween, рН 7,4 ± 1,0) трижды по 5 мин. по окончании промывания срезы слегка подсушивали, заключа Вестник дерматологии и венерологии Научные исследования л 63 ли под покровное стекло в среду, содержащую DAPI, помещали в планшет-папку во избежание выцветания флуорохрома. Полученные препараты анализировали на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе Olympus IX81S1F-S (Германия) с использованием объективов х 60 и х 100. Результаты В биоптатах, полученных из очагов поражения, были установлены характерные для ИАП патологические признаки: у больных вульгарной пузырчаткой наблюдался акантолиз с формированием надбазальных пузырей, в полости которых присутствовали акантолитические клетки; у больных себорейной и листовидной пузырчаткой акантолиз наблюдался на уровне зернистого слоя эпидермиса или сразу под ним, обнаруживались единичные акантолити-ческие клетки. В дерме отмечалась воспалительная инфильтрация различной степени интенсивности (рис. 2). фиксация IgG у больных акантолитической пузырчаткой наблюдалась в межклеточных промежутках в эпидермисе (рис. 3, а), у больного буллезным пемфигоидом — вдоль базальной мембраны (рис. 3, б). Гистологическая картина в биоптатах больных ИАП: а — акантолиз с формированием надбазального пузыря у больного вульгарной пузырчаткой; б — акантолиз на уровне зернистого и верхних рядов шиповатого слоя у больного листовидной пузырчаткой. Окраска гематоксилином и эозином (х 100) Р » Реакция непрямой иммунофлюоресценции с антителами к IgG (х 600): а — фиксация IgG в межклеточных ис. . промежутках в эпидермисе больного вульгарной пузырчаткой; б — фиксация IgG в базальной мембране в коже больного буллезным пемфигоидом 64 L № 6, 2013 в Рис. 4. Реакция непрямой иммунофлюоресценции с антителами к PERP у больных вульгарной пузырчаткой (х 600): а — экспрессия PeRP на мембране кератиноцитов в очагах видимо здоровой кожи; б — отсутствие экспрессии Perp в покрышке пузыря; в — экспрессия PERP на мембране кератиноцитов в участках кожи, прилегающей к пузырю Результаты исследования показали, что у больных ИАп наблюдалась экспрессия белка PERP в области видимо непораженной кожи на мембранах кератино-цитов всех слоев эпидермиса (рис. 4, а). В биоптатах, полученных из очагов поражения у двух больных ИАп, экспрессия белка PERP отсутствовала в покрышке пузыря (рис. 4, б), но сохранялась в участках кожи, прилегающих к пузырному элементу (рис. 4, в). У больного буллезным пемфигоидом Левера установлена экспрессия белка PERP на мембранах кератиноцитов в покрышке пузыря (рис. 5). Во всех биоптатах, полученных от здоровых лиц, экспрессия белка PERP наблюдалась в области мембраны кератиноцитов всех слоев эпидермиса (рис. 6). Реакция непрямой иммунофлюоресценции Рис. 5. с антителами к PERP у больного буллезным пемфигоидом (х 600). Экспрессия белка PERP в покрышке пузыря Реакция непрямой иммунофлюоресценции Рис. 6. с антителами к PERP у здорового добровольца (х 600). Экспрессия PERP на мембране кератиноцитов Вестник дерматологии и венерологии Научные исследования л 65 Обсуждение В настоящем исследовании, проведенном у больных ИАп, впервые установлено наличие экспрессии белка PERP на поверхности кератиноцитов в области видимо непораженной кожи. Экспрессия исследуемого белка у здоровых лиц и в очаге поражения у больного буллезным пемфигоидом Левера также наблю далась в области мембран кератиноцитов. В очагах поражения у больных ИАп установлено отсутствие экспрессии белка PERP. Таким образом, полученные в результате исследования данные об отсутствии экспрессии белка PERP в очагах поражении у больных ИАп свидетельствуют о его вовлеченности в процессы акантолиза

About the authors

A A KUBANOV

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology, Ministry of Healthcare of the Russian Federation; Russian Medical Academy of Postgraduate Studies, Ministry of Health of the Russian Federation

O R KATUNINA

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology, Ministry of Healthcare of the Russian Federation

A V MICHENKO

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology, Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: michenko@cnikvi.ru

T V ABRAMOVA

Russian Medical Academy of Postgraduate Studies, Ministry of Health of the Russian Federation

References

Supplementary files